生长激素STH对体外培养猪COCs卵丘细胞影响的研究.pdfVIP

HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicine No6 2009 · 遗传育种与繁殖 · 生 培养猪 卵丘纽咆影响 研究 王 星 ，罗光彬 ，白秀娟 ，石 娇 ，姜午旗 ，宁方勇 (1．东北农业大学 动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2．沈阳农业大学 动物胚胎工程实验室， 辽宁 沈阳 110161；3．辽东学院农学院，辽宁丹东 118003) 中图分类号：$828 文献标识码：B 文章编号：1004—7034(2009)06—0060—02 关键词：生长激素；猪 COCs；卵丘细胞；凋亡；Bax；Bcl一2 摘 要：试验研究了生长激素(somatotropin，STH)对猪卵丘 一卵母细胞复合体(COCs)的卵丘细胞扩 展、凋亡、凋亡相关基因Bcl一2、Bax表达的影响。结果表明，STH能够促进卵丘细胞扩展，抑制卵丘 细胞凋亡，抑制凋亡相关基因Bax在卵丘细胞上的表达。 猪卵母细胞复合体 (COCs)在体外培养过程中受 添加 1．1mg／mL亚牛磺酸、10％猪卵泡液 (PFF)、 到卵泡大小、卵丘细胞、激素等多种因素的影响。生 100IU／mL青 霉素 和 100 g／mL链 霉素。用 长激素(STH)是由垂体前叶生长激素细胞所分泌的 0．22 m微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 ，备用。所用试 ～ 种肽类激素，为机体生长所必需。生长激素在卵 剂如无特殊说明均购 自Sigma公司。 泡的募集和卵母细胞生长的启动方面有着尤为重要 1．3 猪卵丘细胞凋亡的检测 的作用 ¨。研究表明，STH可显著提高人小腔卵泡 取体外培养 44h的COCs用 PBS洗 3次；加入 卵母细胞的生发泡数量，并可显著提高其体外成熟率 Hoechst33342染色液和PI染色液各5 L，混匀，4。(= 和受精率 。为进一步探讨 STH对猪 COCs的卵丘 孵育20rain。染色后用PBS洗涤 1次，在倒置显微镜 细胞凋亡、凋亡相关基因Bcl一2、Bax的影响进行了 下用荧光显微镜观察、拍照(激发波长 350nm，发射 试验，以期优化培养条件，为体细胞核移植技术生产 波长460nm)。 转基因克隆猪提供大量优质的卵母细胞创造条件。 卵丘细胞凋亡 的判断：细胞发生凋亡时，染色质 1 材料与方法 会固缩。Hoechst33342可 以穿透细胞膜 ，染色后凋 1．1 卵巢的采集与保存 亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。碘化丙啶(PI) 试验用猪卵巢采集于沈阳东生屠宰厂，猪屠宰剖 不能穿透细胞膜 ，对于具有完整细胞膜的正常细胞或 腹后，立即无菌采集卵巢，保存在装有 35～37clC生 凋亡细胞不能染色；而对于坏死细胞，其细胞膜的完 理盐水的保温瓶中，在 2h内送回实验室。 整性丧失，PI可以染色坏死细胞。用上述2种染料 1．2 猪 COCs的收集与成熟培养 双染后，荧光显微镜检测时正常细胞为弱红色荧光 + 卵巢运 回实验室后，用灭菌生理盐水清洗3次。 弱蓝色荧光，凋亡细胞为弱红色荧光 +强蓝色荧光， 用一次性注射器抽取卵巢表面直径2～5mm卵泡内 坏死细胞为强红色荧光 +强蓝色荧光。 的COCs。在体视显微镜下检 出3层以上有致密卵丘 1．4 猪卵丘细胞扩展的测定 细胞层及细胞质均匀的COCs进