第三节DNA片段序列分析的策略.docVIP

第三节? DNA 片段序列分析的策略 一、DNA 片段序列分析的策略?1．Primer walking????原理：将待测 DNA 克隆于噬菌体载体（M13）上，然后通过一定手段将待测 DNA 片断化（DNA 片断化的手段通常有超声波处理和酶切），得到两端彼此重叠的部位不同的若干小片段，再测出每一片段的序列，将各片段的序列依次排列，即能得出总的序列。原理图示如6-5： 3．定向测序　????定向测序的基本策略是沿着目的 DNA 的同一个方向逐渐向前推进，直至目的 DNA 的另一端。可采用嵌套缺失法或引物依次推进法。????嵌套缺失法是利用缺失随机突变原理，先将目的 DNA 克隆到载体上，再用限制性内切酶在邻近其一端处切断载体，使之变成 3 端凹进 5 端突出的线状 DNA ，再用外切酶（exonuclease Ⅲ）或者 DNaseⅠ 加 Mn++ 离子，沿此末端逐步消化目的 DNA ，（只能从 5 突出端开始消化，而不能从 3 突出端开始消化，这是由酶的特性所决定的）（详见后文）。于是只要控制消化时间，即可得到一组依次相差若干碱基，其一端固定于载体另一端游离的目的 DNA 片断，再经末端修饰，重新连接，即可得到一群一端相同但长度不等的目的 DNA 克隆。之后，用同一引物从缺失端开始测序，最后，排列和比较所有子片断的序列，即能得到目的 DNA 的全部序列。 二、测序的基本方案1．制备双脱氧链终止测序的模板????用于双脱氧链终止测序的模板可以是单链 DNA ，双链 DNA ， PCR 产物， BAC 或 Cosmid 。单链 DNA 通常为 M13 噬菌体 DNA（M13mpDNA）， 用于测序的 PCR 产物 DNA 量一般为200-800ng。在进行测序之前，无论选用何种测序策略，用于测序的模板 DNA 均有必要用溴化乙锭－琼脂糖凝胶电泳法确定其纯度和浓度，这是保证测序成功的基本点。2．确定测序的引物????DNA 测序的另一关键在于引物的选择和设计。作为测序引物的寡核苷酸的基本条件主要有以下几点。① 引物长度 18-22 碱基；② 尽量避免三个以上相同碱基的重复，尤其是 G 或 C ；③ Tm 值约为 55-60℃（至少要高于 45℃）；④ 发夹结构尽量少；⑤ 引物自身之间不形成二聚体结构；⑥ 用灭菌后的去离子水溶解合成的寡核苷酸引物，配制成 5-10pmol/(l 浓度，冷冻保存。 引物浓度可以参考算式计算:???? ?? pmol/(l=100 x A260/（1.54nA + 0.75nC + 1.17nG +0.92nT）???A260： 260nm 波长时的吸收值。nA：腺嘌呤 A 的数目；nC：胞嘧啶 C 的数目；nG：鸟嘌呤 G 的数目；nT：胸腺嘧啶 T 的数目。为保证引物纯度，至少应该经过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者纯化度更高的 HPLC 纯化。 三、DNA 自动测序和序列的计算机分析1．原理????基于 Sanger 双脱氧链终止法的原理，只不过不用同位素标记 ddNTP ，而是用四种不同的荧光染料分别标记 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP 。这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，因而每一种荧光代表一种碱基。延伸中的 DNA 互补链分别终止于不同荧光标记的 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP 。2．序列结果????图6-6为测序仪 ABI Prism 310 Genetic analyzer 实际测得的一段 DNA 序列结果。红色代表 T ；绿色代表 A ；兰色代表 C ；黑色代表 G 。 ??3．序列分析????? a.基因序列的信息分析例如，两种序列的比较；基因编码领域，启动子或增强子序列的预测；蛋白质序列的氨基酸顺序的确定；? ?b.新基因的发现通过分析 EST（Expressed Sequence Tag）序列，结合 DNA Chip 技术寻找新基因。? ?c.基因多型性分析分析基因多型性特别是 SNP（Single Nucleotide Polymorphism），发现并定位功能性基因，作为人类群体，进化，或者疾病关联靶标。?? d.高级结构的预测根据测序所得到的核酸一级结构的信息，可以预测核酸和蛋白质的二级结构及其三级结构，从而预测其功能。 第七章 ?定点诱变 Ⅲ、BAL31、DNase Ⅰ 介导嵌套缺失，可以得到系列缺失体。 第一节：寡核苷酸介导的诱变 70年代初 j×174 DNA （ss DNA 5386bp）， ssDNA 与变性的野生型DNA片段一起转染细菌时，“标记获救”现象。即产生带野生型基因组的噬菌体，原因是野生型 DNA 片段与突变体的相应序列退火，形成错配的异源双链体，后者可被