毕赤酵母木糖还原酶定点突变改善其对双辅酶亲和力.pdfVIP

ISSN 1007-7626 20093 CN 11-3870PQ Chinese Journal of Biochemistry and olecular Biology 25(3):250~ 256 1) 1) ,2) * 3) 3) 1) 1) 董莉莉 , 邓小昭 , 钟 辉 , 姚文娟 , 于 娟 , 杨静静 1) 2) ( 南京医科大学基础医学院, 南京 210029; 南京军区疾病预防控制中心, 南京 210002; 3) 中国药科大学生命科学学院, 南京 210009) 通过毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖 原酶(xylose reductase, XR)基因定点突变, 获得NADH 高 亲和力的毕赤酵母木糖 原酶(PsXR) ,改善了辅酶不同而导致的酿酒酵母胞内氧化 原失衡. 同 时克隆了PsXR 编码基因,通过BLAST 工具进行同源性搜索,并用生物软件进行序列比对和结构分 析,确定突变位点.用融合PCR 方法进行定点突变,并在大肠杆菌表达系统中进行融合表达,且对 表达产物进行HIS-TAG 亲和纯化,分光光度法检测酶活性,计算比活力. 本研究成功获得突变XR 编码基因, 并收集了纯化的突变蛋白. 酶活性检测和比活力计算显示,3种突变酶对2种辅酶的亲 和力在一定程度上都发生了变化. 与未突变的PsXR相比,3种突变酶对辅酶NADPH 的亲和力均显 著下降,突变酶 3对辅酶NADH 的亲和力未发生变化, 而突变酶 1和 4 对辅酶NADH 的亲和力 显著升高, 其中突变酶 1 对NADH的亲和力明显提高, 对NADPH 的亲和力明显下降, 其活性主要 依赖辅酶NADH, 提示K270R 位点在XR 与辅酶结合中起关键作用. 木糖; 木糖 原酶; 原型辅酶Ñ(NADH); 原型辅酶Ò(NADPH) Q816 Modification of Dual-coenzyme Affinity of Xylose Reductase from Pichia stip itis by Site-directed Mutagenesis 1) 1) ,2) * 3) 3) 1) 1) DONG L-i Li , DENG Xiao-Zhao , ZHONG Hui , YAO Wen-Juan , YU Juan , YANGJing-Jing 1) ( School of Basic Medicine, Nanj ing Medical University, Nanj ing 210029, China; 2) Center of Disease Prevention and Control,