鲤均一化全长cDNA文库构建、大规模测序及信息学分析.pdfVIP

Thesis for the Degree of Master Construction and sequencing of normalized full-length cDNA library and Analysis of Bioinformatics in Common Carp (Cyprinus carpio ) Dissertation Submitted to Dalian Ocean University In partial fulfillment of the requirement For the degree of Master of Science By Xu Ru Dissertation Supervisor: Sun Xiaowen, Professor June 2014 摘要 摘 要 鲤鱼(Cyprinus carpio) ，原产于欧亚大陆，是世界上重要的水产养殖鱼类。为进一步分 析研究鲤鱼转录组数据及其功能基因，我们构建了鲤均一化全长cDNA 文库。本研究以1 龄雌性鲤鱼的八种组织为材料，包括血液、鳃、卵巢、肝胰脏、头肾、体肾、心和脑组织， 利用Cap-trapper 法，制备成全长Uncut cDNA 原始文库。对原始文库进行检测，文库总克 6 隆数 （CFU ）为6.4×10 ，重组率大于95% 。采用基因组DNA 饱和杂交原理，对文库进行 5 均一化处理，从而构建了鲤鱼均一化的全长cDNA 文库，CFU 为2 ×10 ，重组率大于95%， 插入片段平均长度大于1.0kb ，全长比例大于90% 。qPCR 检测表明，文库均一化后，β-actin 丰度相对于均一化前降低了87 倍。 对均一化后的文库随机挑取43008 个克隆，利用M13F(-20)通用引物进行5’端测序， 成功测序并得到29779 条序列。序列处理后聚类拼接，获得15116 条非重复序列（unigene ）， 并提交至NCBI 数据库。对得到的unigene 进行长度分布及GC 含量分析，序列长度主要 分布在300bp-700bp 间，平均长度为540bp ；GC 含量分析表明鲤鱼基因cDNA 序列中GC 含量为45.53 ％。基于本地Linux 平台，使用BLASTX 与无冗余蛋白数据库 （NR ）进行比 对分析，对8437 条序列进行了注释，包括分子功能、生物学过程和细胞组分三个层次, 其 中细胞组分分为13 个部分，分子功能分为12 个部分，生物学过程分为22 个部分。 从本文库筛选出3 个Rab1a 基因，分别为Rab1a-1、Rab1a-2 和Rab1a-3 。应用鲤BAC 文库对Rab1a-1 和Rab1a-2 进行全长测序及信息学分析，绘制出基因结构图；随后，对它 们的蛋白二级及三级结构进行比对作图，并构建系统发育树；最后，分析了 Rab1a-1 和 Rab1a-2 在不同组织的表达，以及低氧条件下它们表达的差异并对功能进行初步研究。 关键词：鲤鱼均一化全长cDNA 文库；测序；信息学分析；Rab ；差异表达 I Abstract Abstract The common carp (Cypr