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实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 提纲： 实时荧光定量PCR原理 数学原理 化学原理 实时荧光定量PCR的方法应用 绝对定量 相对定量 定量PCR的实验要素 平台定量PCR仪器介绍 实时荧光定量PCR定义： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号累积实现了实时监测整个PCR 进程，对起始模板进行定量分析的方 法。 与普通PCR 的区别 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起 始模板进行定量。 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个 值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意 位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景） 荧光信号的标准偏差的10 倍。 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所 经历的循环数被称为CT 值 （threshold value ）。 定量PCR 的数学原理 斜率与扩增效率 荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标记： 1、SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 1、SYBR Green 法 SYBR Green 熔解曲线分析 SYBR Green法优缺点 优点: 对DNA模板没有选择性 适用于任何DNA 使用方便--不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 2 、TaqMan探针法 TaqMan作用机理 TaqMan法优缺点 Real-time PCR 方法应用 •绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 •相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 绝对定量与相对定量的定义 绝对定量通过标准品定量 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： •含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 •含有和待测样品相同扩增片段的cDNA •PCR的产物 绝对定量：从荧光到拷贝数 相对定量通过内标定量 内标（Endogenous Control）通常是β- actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒 定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组 数量 相对定量：参照因子Calibrator 相对定量分析方法1 - ΔΔCt 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏 差在 5 ％以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： ΔCT （test)= CT （target,test) - CT （ref,test) ΔCT （calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值： ΔΔCT= ΔCT （test) - ΔCT （calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 – ΔΔCT=表达量的比值 相对定量分析方法2 ：双标准曲线法 目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度 定量PCR的实验要素 样品 ●DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 ~ 2.0之 间 ●DNA用量：0.05 ng –100 ng ●RNA纯度：OD260/OD280=2.0 ●cDNA用量：1-100 n