纤维素磁性微球在病原微生物检测中应用的研究.pdfVIP

离子交换与吸附, 2010, 26(5): 431 ~ 438 ION EXCHANGE AND ADSORPTION 文章编号：1001-5493(2010)05-0431-08 纤维素磁性微球在病原微生物检测中的应用研究* 白 芳 1 张 奇 1 王 龙 2 张 玺 1 孙 丹 3** 白 钢 1,2 1 南开大学药学院，天津 300071 2 南开大学生命科学学院，天津 300071 3 南开大学学报编辑部，天津 300071 摘要：采用反向悬浮包埋技术和高速匀浆法制备了不同粒径的纤维素磁性微球，扫描电镜和铁 离子分析结果表明，最佳粒径为 5.82µm。后采用自行构建并表达的融合蛋白 CBD-ProA 和沙 门氏菌多价抗体对最佳粒径的纤维素磁性微球进行活化，获得免疫磁性微球，其抗体偶联量为 186.8mg/mL。最后采用致敏的免疫磁性微球分别对污染沙门氏菌的饮用水、牛奶和花生酱等样 品进行免疫磁性捕获及分子鉴定，其检测限均可达 10cfu/100mL。本研究开发的免疫磁性捕获 技术，具有微球活化速度快、工艺简单、使用便捷等优势，同时，建立的免疫磁性捕获-PCR 的方法与国标法相比，检测时间缩短 48h ，在食品安全、环境检测等方面具有实用价值。 关键词：沙门氏菌；免疫磁性捕获；CBD-ProA 中图分类号：Q815 文献标识码：A 1 前 言 磁性微球 (MMS) 又称磁性微珠，因其表面可以赋予各种与生物活性物质反应的特殊 功能团，已被广泛应用于生物活性配体的载体，同时又因其具有超顺磁性，可方便的利用 磁场进行定位；经过共聚或表面改性，使其表面含有许多功能基团，可吸附抗体、蛋白质、 核酸等，从而可用于细胞分离、核酸分离、免疫检测以及靶向药物等方面，具有极其广泛 的应用前景[1-7] 。 免疫磁性分离 (Immuno-magnetic capture) 技术是依赖于免疫磁性微球的一种分离技 术，已应用于医学、生物学以及环境和食品卫生检测等方面[8-13] 。纤维素免疫磁性微球可 以通过双功能融合表达蛋白CBD-ProA 进行生物活化，具备活化速度快、工艺简单、使用 便捷等优势。 纤维素结合域 (Cellulose Binding Domain, CBD) 是能够结合纤维素但不具有水解酶 活性的纤维素酶的重要组成成分，目前，已被广泛应用于酶和细胞固定化、生物分子的分 * 收稿日期：2009 年 10 月 14 日 项目基金：天津市应用基础与前沿技术研究计划 (08JCYBJC04400) 作者简介：白芳(1980~), 女, 天津市人, 博士, 讲师. ** 通讯联系人: sundan@nankai.edu.cn ·432 · Ion Exchange and Adsorption 2010 年 10 月 离纯化、免疫诊断以及工农业技术开发等研究中[14-15] 。采用 CBD 融合表达蛋白进行 MCMS 的活化研究在前期的工作中已经报道，该蛋白质片断可以与其他蛋白质融合表达，并有效 地偶联到 MCMS 表面，使其活化[16] 。 食品中微生物快速检测方法包括微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学、免疫 学和血清学等方面及它们的结合应用。国标法对食品和水资源中微生物检测做了包含样品 制备、前增菌、增菌、分离和生化鉴定等一系列相应的规定，是微生物检验的权威标准， 但是该方法较为费时，费力。分子生物学鉴定主要包括聚合酶链式反应 (Polymerase chain reaction ，PCR) 、核酸探针及基因芯片等方法，但存在各式各样的假阳性问题，有待进一 步解决[17] 。 本研究将免疫磁性捕获技术与分子鉴定相结合，利用免疫学反应的特异性将目标微生 物从复杂的样品中分离，随后对其进行特定基因的分子鉴定，进而完成样品的微生物检测， 该方法与国标法相比检测时间可以节省 48h ，并且劳动强度低，灵敏度高，还可以放大检 测样品量，使检测更加精确。 2