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AN66 高效液相离子交换色谱－脉冲积分 安培检测法检测新霉素B 及其杂质 绪论： 新霉素是水溶性的氨基糖苷类抗生素复合体，一般是从弗式放射菌链霉素的 发酵产物中纯化出来的，在制药行业中，包括眼药、口服药和静脉注射液 （如 [1] Neosporin，NeoDecadron，PediOtic 和Suspension ）等 ，有着广泛的应用。 新霉素B （也被称为弗式菌丝）是新霉素复合体中含量最高、活性最强的一类。 弗式发酵液中可能还会含有一些其它的活性新霉素如新霉素 A （也被称为新毒 胺），新霉素C，新霉素D （也被称作巴龙胺霉素），新霉素 E （巴龙霉素I）和 新霉素 F （巴龙霉素II）。发酵过程会对新霉素A ，B 和C 产生乙酰化作用，从 而降低它们的抗生效用（LP＝降低效力），生成新霉素 LP-A （单氮乙酰化新毒 胺或3－乙酰新毒胺，低效力），新霉素LP-B （单氮乙酰化新霉素B 或在较早的 文献中被称为 LP-I）以及新霉素C （单氮乙酰化新霉素C 或在较早的文献中被 称为LP-II）。有报道称，在检测S 弗式发酵液中抗真菌物质新霉素以及其它抗生 [2-3] 素类物质时 ，同时检测出一些杂质，而这些杂质是在化学降解或贮藏过程中 [4] 引入的 。例如，在酸解产生新霉素B 的过程中会引入新霉素A 和新生物胺B， 水解产生新霉素C 的过程会引入新霉素A 和新生物胺C。新生物胺B 和C 分别 由D－核糖与新糖胺B 和C 构成。现行的美国药典（USP 29，NF24）推荐检 测硫酸新霉素的方法中规定，新霉素B 为主要抗生素成份，新霉素A 和C 为杂 [5] 质 。现行的欧盟药典（第五版）规定，新霉素B 为主要成份，而新霉素A ，C， [6] D，E，A-LP 以及B-LP 为杂质 。图1 给出的是新霉素B 以及其主要杂质的化 学结构。一般情况下，主要成份（新霉素B）及所有杂质的浓度都必须被检测出 来，而这些浓度都必须符合相应指标后，才能进行临床使用。这些氨基糖苷类抗 生素及其杂质的结构和糖类似，都没有明显的发色基团，所以如果要用紫外－可 见光检测器的话，灵敏度达不到要求。另外在制备和贮藏过程中引入的一些中间 体或杂质具有较好的紫外或可见光吸收基团，使用紫外－可见光检测器直接进样 分析会有很大的干扰新霉素 B 及其杂质的定量。视差折光率检测器与紫外－可 见光检测器的局限性类似。糖类、糖醇类、醇类、胺类以及含硫物质可以在安培 检测器上进行氧化，得以直接检测。该检测方法对上述这些类型的物质的检测机 理是，在选定电位对其进行氧化后，用脉冲积分安培检测法对这些特定物质进行 有选择性地检测。这是一种非常强大和实用的检测技术，具有很宽的线性范围和 非常高的灵敏度，是一种非常适合于分析氨基糖苷类抗生素的理想检测器[7－12] 。 图1 新霉素B 和一些已知杂质的结构图（包括新霉素A ，B，C 和新生物胺A 和B） 高效阴离子交换色谱（HPAE）可以做为一种分离新霉素B 及其杂质的手段 [7，10] 。我们选用的CarboPac PA1 阴离子交换柱可以将新霉素B 及其杂质进行 分离，但是，前提是需要2.40 mM 的NaOH 做为淋洗液，才能够实现。2.40 mM 的 NaOH 淋洗液在配制起来比较困难，浓度不易掌握，且容易引入碳酸盐在淋 洗液中。淋洗液中不同浓度的碳酸盐会影响保留时间的重现性和精度，该问题限 制了 HPAE－IPAD 检测新霉素方法的适用性。在此应用手册中，我们实用淋洗 液在线发生装置替代以往手工配制的淋洗液，很好地解决了这个问题。淋洗液发 生装置可以自动产生精度非常准确氢氧化物淋洗液，最重要的是，这些淋洗液是 不含碳酸盐的。EG50 淋洗液发生装置通过电解水产生氢氧化钾（KOH）淋洗液， 最大程度上避免了碳酸盐的引入。此时流动相中唯一可能引入碳酸盐的环节就是 去离子水，我们将连续自动再生阴离子捕获柱（CR-ATC ）安装在EG 装置之后， 可以将淋洗液中少量的碳酸盐，以及硼酸盐或所有其它阴离子污染物去除。因此， 使用EG50 装置