荧光性假单胞菌抗性基因筛选1125.pptVIP

荧光性假单胞菌抗性基因的筛选 实验背景 荧光假单胞菌可产生10 多种具有抗菌作用的 抗生性次级代谢产物 藤黄绿脓菌素【Plt】 硝吡咯菌素【Prn】 2，4-二乙酰基藤黄酚【Phl】 生物表面活性剂（环脂肽【CLP】、鼠李糖脂） 嗜铁素( 水杨酸、绿脓杆菌螯铁蛋白、青脓素) 卵菌素A 氢氰酸 邻氨基苯甲酸 随着生物工程技术的发展，从分子水平对藤黄绿脓菌素(Plt) 、2，4-二乙酰基藤黄酚(Phl) 、硝吡咯菌素(Prn) 、环脂肽(CLP)等抗生性次级代谢产物的合成机制进行了深入研究，与其相关的功能基因已经被鉴定。 本实验设计了针对特定基因的引物，利用PCR技术，筛选可以产生藤黄绿脓菌素(Plt) 、2，4-二乙酰基藤黄酚(Phl) 、硝吡咯菌素(Prn) 、环脂肽(CLP)的荧光性假单胞菌 实验流程 一，实验准备 1，配置LB培养基，灭菌 2，96孔板清洗干净，包好 灭菌 3，移液器枪头（1mL，200uL，10uL）， 0.2mL PCR管，1.5ml EP管，包好灭菌 4，去离子水，灭菌 二，荧光性假单胞菌菌种的活化 1，在96孔板的每个孔中加入540μl LB培养基 2，接入60μl甘油菌 注意：这一步要做好记录，记清楚每个孔中接入 的是那一株菌种 注意：每一组学生接种一支阳性菌株Pf-5 3，将接过菌的96孔板置于28℃摇床过夜培养 注意：96孔板需固定好，防止倾斜导致菌种 交叉污染 接种记录表格 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Pf-5 B C D E F G H 三，菌落PCR 所用引物 a. 环脂肽CLP: (1) PGPRB-4965/PGPRB-4966 (2) PGPRB-5045/PGPRB-5046 b. 2,4-乙酰藤黄酚Phl: Phl2a/Phl2b c. 硝吡咯菌素Prn: Prnd1/Prnd2 d. 藤黄绿脓菌素Plt: PltC1/PltC2 三，菌落PCR PCR体系: 20ul 灭菌去离子水 15.2 ul 10×buffer 2 ul dNTP 0.8 ul 上游引物 0.4 ul 下游引物 0.4 ul Taq酶 0.2 ul 模板 1 ul 以8个样品、1个阳性对照（Pf-5）和1个阴性对照为例的MIX ×10 PCR H2O 15.2ul 152ul 10×buffer 2ul 20ul dNTP 0.8ul 8ul 上游引物 0.4ul 4ul 下游引物 0.4ul 4ul Taq酶 0.2ul 2ul 在EP管中加入试剂后，分装入10个PCR管中，19ul/管，其中1管作为阴性对照，1管作为阳性对照，加入1uL Pf-5菌液作为模版，剩下8管分别加入1ul 模板 菌落PCR实验流程 根据各组所做的模板数目计算mix，依次加入除模板之外的各试剂后混匀，离心，分装19 uL入PCR管，对PCR管进行编号 将活化好的菌液取100 uL按照编号从96孔板分别移到1.5mL EP管中，盖紧盖子，置于沸水中煮10分钟。离心，各取1 uL作为模板加入PCR管中 将PC