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锦鲤雌核发育研究初探 梁拥军 锦鲤是一种极具观赏价值的鱼类，素有“活明珠和“水中之花”的美称Ⅲ。近百年 来，世人对锦鲤的观赏兴趣日渐浓厚，通过杂交选育出了各种不同的观赏品系，如红白、 大正、昭和等，并将其传向世界各地。锦鲤在养殖和观赏过程中主要是以色斑这一表型 特征进行挑选，加之养殖条件的限制，致使养殖者很难预测杂交子代的花色，只有通过 无数次繁育，方能从千万条中获得几条具观赏价值的锦鲤，造成人力物力的极大浪费， 养殖效率低下。因此，构建一系列具有观赏价值的锦鲤纯系，使育种者能有效地预测和 控制花色，是目前锦鲤育种中亟待解决的难题。 采用人工雌核发育技术，辅以人工性逆转技术就能培育出全雌鱼。应用雌核发育技术 还可快速建立纯系乜3，并且可以利用获得的雌核发育纯系进行杂交以提高鱼类的养殖性 能。本研究中，作者采用经紫外线照射的团头鲂精子与锦鲤卵子结合，用热休克法抑制受 精卵第二极体的释放和第一次卵裂诱导锦鲤雌核发育二倍体，对紫外线的照射剂量和热 休克处理的起始时间进行筛选，以期找到最佳的诱导参数组合，为进一步研究全雌苗种 的培育和雌核发育纯系的建立打下良好的基础。 一、材料与方法 1、实验材料 性成熟的雌性锦鲤、雄性团头鲂均取自北京水产研究所小汤山实验基地。 2、实验方法 在繁殖季节，选取已达性成熟的雌性锦鲤和雄性团头鲂，注射促黄体素释放激素 la A2(LRH．A2)20 规方法获取卵子和精子。 2．1精子的遗传失活处理 7．5 精子的遗传失活采用紫外线照射法。将采得的成熟团头鲂精液用HankL乇液(NaCl 0．4 000 g,CaCl2g，KCl0．2吕蒸馏水1 mL，pH7．0～7．3)以l：5稀释后均匀涂铺于直径为9 cm的玻璃培养皿中，精液厚度不超过5mm，再将培养皿置于冰盘上以紫外线进行照射，并 在照射期间时时摇动，以确保精液受到均匀处理【3】。辐射源为1支20W的紫外灯管，波长 253．7 u nlll，辐照度92W／cm2。紫外灯管与混合精液面垂直距离为10crn。照射时间分别 设置为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35rain七个梯度。以未进行照 射的正常精子作为对照。 2．2受精卵染色体加倍操作 用挤压法采得锦鲤的成熟卵子后，以人工干法授精(即激活过程)获得受精卵。试验分 别研究通过抑制第二极体排放和通过抑制第一次卵裂来实现染色体加倍，故将热休克处理 卵裂)范围。取一定数量的受精卵置于按2min和3minl自J隔梯度设置的系列培养皿中，并在 热休克处理前分置于24C水温中预孵育，之后再同时转入水浴中进行热休克处理，每个试 验组设3个平行。试验根据前人的研究结果，将热休克处理温度设为38-39C，热休克处理 持续时间为2mint4|。 3、孵化期管理及受精率、存活率的统计 将热休克处理后的受精卵置于24-1-1℃的恒温水浴环境中静水孵化，每隔一定时间清 除死卵并记数。以发育到囊胚期的胚胎数占总卵数的比例作为受精率[习，孵化后计数各组出 膜仔鱼数量(处理组计数单倍体仔鱼数目，对照组计数正常仔鱼数目)，并转换成孵化率。 4、染色体制片与倍性鉴定 对刚孵化出来的仔鱼进行倍性检测，从染色体水平证实雌核发育的诱导效果。采用 单个仔鱼染色体制片法。参照洪云汉【6】的方法，略有改动。分别随机选出对照组和各处理 镜下镜检并拍照。 二、结果 1、紫外线照射时间对团头鲂精子遗传失活效果的影响 以不同时长的紫外线照射团头鲂精子后，受辐射精子与卵子结合的受精率、胚胎孵化 率和单倍体率见表l。从表中数据可知，随着照射时间的延长，受精率和孵化率先下降后 升高，在照射25 min时达到峰值，接着又下降，显示／出Hertwig效应【71，经倍性鉴定证实，峰 3项指标来考虑，精子的遗传失活处理时间设为25min最为适宜。 表1不同紫外线照射剂量照射团头鲂精子对锦鲤卵子受精率、胚胎存活率及单倍体率的影响 Tab．1TheinfluenceofdifferentUV