单克隆抗体的制备05510.docVIP

单克隆抗体的制备 抗原的制备： （1）全病毒作为抗原 （2）病毒特定蛋白作为抗原 二．动物免疫 三．融合：（1）骨髓瘤细胞准备 （2）脾淋巴细胞准备 （3）饲养细胞准备 （4）细胞融合 四．杂交瘤细胞的检测及筛选 五．阳性杂交瘤细胞的亚克隆 六．腹水的制备 ---------------------吼吼吼，俺是分界线，吼吼吼------------------------------------------------------------ 七．单抗特性的鉴定：（1）单抗效价测定 （2）单抗特异性鉴定 （3）杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定 八．单抗的反应性：（1）间接ELISA试验 （2）间接免疫荧光试验 （3）微量细胞培养中和试验 抗原制备 (一) 全病毒作为抗原 1.收获病毒 ①直接收获病毒马立克是细胞结合性病毒离心重悬收获病毒冻融使细胞破碎释放出病毒； 3.慢慢搅动并加入NaCl终浓度是0.5mol/L,有助于病毒的沉淀，再等量加入10％PEG(一般使用PEG6000)； 4℃过夜或放置一段时间； 8000r/min离心30分钟，收集病毒沉淀； 病毒沉淀，4℃过夜； 1000r/min离心1小时沉淀即为浓缩的病毒 8.用 2mL的PBS溶解 9.测病毒浓度（用紫外分光光度计测蛋白质浓度A280） 10.一80℃保存备用——病毒的冻存（具体程序是什么） ①使用灭菌过的 1 次性塑料冻存管。贴上标签, 标上菌(毒)号及时间, 备用。 ②血清, 可用过滤灭菌; 牛奶要先脱脂, 用离心方法去除上层油脂, 一般在 100℃间歇煮沸 2～3 次, 每次 10～30min, 备用。 ③在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期, 进行纯度检查后, 与保护剂混合均匀, 分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108～1010个/ml 为宜。 病毒特定蛋白作为抗原 原核表达载体的构建： ①目的基因引物设计 ②PCR扩增目的片段 ③选取适当带标签的表达载体与目的片段进行连接 ④转化，获得阳性质粒。 蛋白表达： ①将阳性质粒转化入表达感受态细胞 ②挑菌小摇至OD值在0.4-0.6之间时，添加IPTG诱导蛋白表达 IPTG浓度：0.1-1.0mmol/l 诱导温度和时间：37℃——4h 30℃——6h 25℃——12h 16℃——17h ③对诱导的大肠杆菌菌液6000rpm离心10min ④用1:100PBS重悬细菌 ⑤超声波破碎细胞 ⑥检测蛋白质是上清表达还是包涵体表达 蛋白质的纯化 若蛋白质是上清表达，根据标签直接进行纯化 若蛋白质是包涵体表达，先用尿素分离为上清再纯化 菌体破碎→离心→等电点沉淀→亲和层析 二.动物免疫 1.将浓缩后的病毒抗原稀释成浓度为100ug/ml或蛋白浓度（有具体的浓度吗） 2.选取5只6周龄左右雌性BALB/c小鼠 3.第一次免疫：将抗原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化,采用腹部皮下多点注射,剂量0.2-0.4mL/只（蛋白腹部皮下注射100ug） 第二次免疫：2一3周，将抗原与等量弗氏不完全佐剂充分乳化,皮下多点注射,0.2-0.4mL/只（蛋白腹腔注射100ug） 第三次免疫：2周，方法和剂量同第二次 4.测血清抗体效价 一周，断尾采血，ELISA包板测效价 选择效价高的小鼠，用不加佐剂的抗原尾静脉注射加强免疫,剂量O.lml/只,(蛋白为腹腔注射100ug) 3d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合 三.融合 (一) 骨髓瘤细胞的准备 1.融合前两周 ：开始复苏骨髓瘤细胞SP2/O,扩大培养,融合时确保SP2/O处于对数生长期（如何确定骨髓瘤细胞处于对数生长期）,有良好的形态（骨髓瘤细胞的正常形态是什么样的）,活细胞计数高于95% 2.融合当天,用DMEM不完全培养基将细胞从瓶壁轻轻吹下,收集于SOmL离心管内 3.10O0r/nin离心IOmin,弃去上清