大肠杆菌的培养.docVIP

大肠杆菌的培养 1、大肠杆菌 （1）特性： 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 （2）用途： 基因工程技术中被广泛采用的工具 2、培养： LB液体培养基 —— 扩大培养 LB固体培养基 —— 分离 培养基的配制：基础培养基（LB培养基）:含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。 细菌培养基的特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化钠，酸碱度：中性偏碱 a.固体培养基 通常加琼脂，作为凝固剂 （凝固剂的要求：不被微生物利用，又可使培养基固化，且不影响培养基中的其他营养物被细菌吸收） 作用：分离（纯化）细菌、计数、保留菌种等 b.液体培养基 不加琼脂等凝固剂其它成分与固体培养基相同 作用：培养细菌 高压蒸气灭菌： 条件： 1kg/cm2压力、121℃、15min 可灭菌培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、三角刮刀、接种环、镊子、无菌水、培养基（高压蒸汽灭菌不会破坏培养基的营养成分） 分离细菌方法 一、划线分离法 1）灼烧接种环； 2）接种环冷却后，蘸取带菌培养物 3）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养基上划线。 划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。 二、涂布分离法 1) 稀释菌液 （10-5 ~ 10-7倍） 用无菌吸管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。…… 3) 涂布 用无菌吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。 4) 培养 将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h 液态LB培养基的配制： 1L溶液的制备：在950ml的去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取液5g、氯化钠10g。调节pH LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。 碳源和能源：酵母提取物，氮源：磷酸盐、蛋白胨，无机盐：NaCl。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。 由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 LB培养基的配方如下：酵母提取物 5g、蛋白胨 10g、NaCl 5g、琼脂 15～20g、水 1000mL、pH 7.4～7.6 实验器材：酵母提取物，蛋白胨， NaCl，琼脂；1mol/L NaOH， 1mol/L HCl；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 实验步骤： 1．称量 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。 2．溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。 3．调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。 4．分装 (1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。 (2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 (3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 5．加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 6.包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、