转基因食品的检测方法材料.docVIP

转基因食品的检测方法 1核酸水平 主要检测报告基因、启动子和终止子，是当前转基因产品检测的重要手段。椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因食品提供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。 1．1定性检测 1．1．1聚合酶链式反应(PCR) ??? 1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。利用该方法在鉴定转基因抗除草剂大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和转基因抗虫玉米系列标准品Btl76 Maxi maizer的实验中，可以检测到仅为0．5％转基因成分。Matsuoka等通过对7种转基因玉米转入的外源基因的序列分析，设计了14对检测该7种转基因玉米启动子、终止子和结构基因的引物，分别对转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、非转基因大豆进行了PCR扩增检测，同时为检测所设计引物的特异性，还对其他作物如水稻、大麦、小麦等进行了PCR扩增，检验结果表明该方法能够快速有效地检测转基因玉米品种。曹际娟等对转基因玉米及其粗加工食品，如爆米花、熟玉米棒、速溶玉米片的基因进行了PCR定性检测，指出利用该方法检测外源基因成分含量的底限可达到0．1％。目前，该方法在检测转基因食品的应用中，还存在一些问题，如从食品中提取DNA的效率，可能存在的PCR抑制剂， DNA的降解，可能存在的RNA，以及选择合适的靶序列的引物来保证扩增的成功等，这些都可能成为制约鉴定结果成功与否的因素。在实验过程中，PCR的污染及条件的重复性是实验判定结果的关键。每一次实验均需要设有阴性及阳性对照以确保实验结果可靠性。在样品采集及处理过程中也需要注意防止污染。 1．1．2多重PCR 多重PCR是常规PCR方法的改进，它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。这种方法具有更大的可靠性和适应性，并且能降低检测成本。多重PCR可以同时针对几个靶位点进行PCR技术检测。V．T．Forte等利用其设计的多重PCR方法对转基因大豆和Bt玉米样品进行实际检测，结果表明该方法能够准确的检测食品中是否含有转基因成分，其检测结果可以精确到2％～0．1％的范围。Permingeat等仅用两对引物就可同时检测出转基因玉米Btl76、 MON810、Btll和T25的CrylA(b)和pat基因。多重 PCR也可同时准确地扩增出Roundup Ready大豆的 NOS和epsps序列片段。 1．1．3巢式和半巢式PCR(nested PCR and semi-nested PCR） ??? 巢式PCR(nested PCR)是在普通PCR基础上发展起来的一种PCR技术。其原理是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR反应对某个基因进行检测。 ??? 半巢式PCR(semi nested PCR)的原理与巢式PCR基本相同，只是半巢式PCR只有一对半引物，有一个引物被用于二次PCR反应中。这两种方法不但可以减少假阳性的出现，而且可以使检测的下限下降几个数量级。在DNA受到严重破坏的大豆加工品豆油、大豆磷脂以及其它产品中，用普通PCR不能完全检出是否含有大豆成分和转基因大豆的成分，即使检出，其重复性也不好。而利用巢式PCR和半巢式PCR可以克服普通PCR的这一缺陷。在用巢式和半巢式PCR对市场的食品原料和深加工食品进行检测时，可以从大豆油、酱油、面酱、大豆磷脂、豆腐、豆浆等食品原料和深加工食品的17个品牌的食品中检测出大豆内标基因(house-keeping gene SLectin。其中2种食品原料和深加工食品的11个品牌的食品中检测出外源基因 CaMV35S—CTP4基因片段，说明这些食品中含有转基因大豆成分，占被检测食品的76．5％。 1．1．4核酸印记法(southern blot) ??? 以放射性或荧光标记的外源目的基因的同源序列作为探针与该食品原料农产品的总DNA进行杂交。首先用限制酶消化受体总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得的片断，随后使DNA在原位发生变性，并从凝胶转移至一固相支持体上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片断的相对位置保持不变，用放射性或荧光标记的探针与各个DNA片断杂交，经放射自显影确定与探针互补的电泳条带的位置。核酸印记法技术用于食品外源基因的检测可检测出外源基因与内源基因有高度同源性的DNA片断，且准确可靠，但对样品的纯度要求较高，费用也较高。 Wu等用核酸印迹法判断出西红柿的假定的转化株的基因组DNA中含有转入的DNA。Jennings等用核酸印迹法杂交判断Bt玉米中crylAb基因的211 bp片段和玉米内源基因sh2(编码ADP葡萄糖焦磷酸化酶)