基于蛋白质组学的细胞色素I)450和葡萄糖醛酸转移酶亚型绝.pdfVIP

第42卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告 第1期 2014年1月 ChineseJournalof 10～15 AnmyficalChemistry 基于蛋白质组学的细胞色素I)450和 葡萄糖醛酸转移酶亚型绝对定量分析 刘喜东1 朱俊2 丛宇婷1 胡良海“ 叶明亮2 顾景凯1 邹汉法2 1(吉林大学生命科学学院，长春130012) 2(中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，大连116023) 摘要利用蛋白质组学方法，将大鼠肝微粒体样品进行胰蛋白酶水解；再利用液相色谱一串联质谱法(LC— MS／MS)，采用多反应监测模式(MRM)，通过测定蛋白质水解后产生的特征酶切肽段，实现同时对大鼠肝微粒 体内药物代谢酶P450和UGT的绝对定量。本实验首先建立标准工作曲线，对肝微粒体样品中P450和UGT 进行定量，在线性范围内，相关系数r0．995，线性关系良好，定量限≤10nmoL／L；以合成的稳定同位素标记特 征肽段作为内标，对UGTlAl进行定量分析。结果表明，同位素标记特征肽段与未标记肽段色谱行为与质谱 响应一致，在基质溶液中同位素标记肽段线性关系良好，利用标准曲线法和稳定同位素稀释法测得UGTlAl 含量分别为17．30和18．23 nmol／g，两种方法所得结果基本一致，但稳定同位素稀释法操作简便，更适用于复 杂样品的高通量测定。 关键词 葡萄糖醛酸转移酶；多反应监测；肝微粒体；细胞色素P450；气相色谱一串联质谱 1 引 言 药物进入体内，可以通过代谢以一种或多种有活性的或无活性的代谢产物形式进行清除。当药物 主要以代谢方式清除时，代谢途径对药物的安全性和疗效有很大的影响¨’2J。在参与药物代谢的各类 谢反应。因此，实现对P450和UGT家族中多种酶的定量，对研究药物代谢具有重要意义，从而为药物 研发、药物一药物相互作用(DDI)及临床前药代动力学研究提供科学依据。在过去的研究中，常通过逆 转录聚合酶链式反应法(RT．PCR)旧4J、2．维电泳法(2D．PAGE)1、免疫印迹法(Western blotting)∞’刊及 探针底物法旧，91对药物代谢酶进行评价。由于mRNA的翻译过程受多种因素的影响，因此测得的 mRNA的量不能准确代表蛋白酶的水平；又因为药物代谢酶具有高度的序列同源性，使得现有方法专 属性差，伴有一定的交叉反应，这些方法卜的缺点都限制了对药物代谢酶的研究。 随着质谱技术的发展和在蛋白质组学研究中的应用，实现了对复杂体系中蛋白肽类物质的定性和 定量研究【1¨14]，也为药物代谢酶的定量提供了理论依据和实验基础。本实验通过分析药物代谢酶的氨 基酸序列，找出能代表各蛋白酶的特征肽段，利用高效液相色谱．串联质谱技术以及标准曲线法，同时实 现对P450和UGT的直接定量分析；以合成的同位素标记肽段作为内标，对复杂基质中待测物进行定 量。以往的间接定量实验操作繁琐，影响因素多，所得结果不能直观反应实际药物代谢酶水平。本实验 具有准确性高，重现性好，定量限低，高通量等优点，可用于药物代谢酶的相关研究。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 1．4．2 APl4000型液相色谱一串联质谱仪(美国ABSCIEX公司)，配有电喷雾离子化源以及Analyst 2013聊-29收稿；2013一10．22接受 本文系国家自然科学基金项目(No和教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET一120234)项目资助 女E—mml：lmghaihu@jlu．edu．en 万方数据 第1期 刘喜东等：基于蛋白质组学的细胞色素P450和葡萄糖醛酸转移酶亚型绝对定量分析