核型多角体病毒p74基因在苏云金芽胞杆菌中克隆及研究论文.pdfVIP

微生物实用技术生态环境应用学术研讨会 核型多角体病毒p74基因在苏云金芽胞杆菌中 克隆及研究 叶湘漓，夏立秋· 中国．湖南．K沙．湖南师范大学医学院，410081 究奠定基础。 关键词：苏云金芽孢杆菌，核型多角体病毒，crylAc基因，p74基因。融合基因 苏云金杆菌(Bacillus (ICPs)，其中应用丁．农业生产的主要是6．内毒素。6．内毒素最初是以没有活性的原毒素形式存在丁伴 孢晶体中，当伴胞晶体被敏感比虫吞食、进入消化道后，在比虫中肠道的碱性环境卜．，溶解并释放出原 毒素，进而往酶的作心卜．降解成为有活性的毒素：毒素随后与敏感昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜泡(brush bordermembrane 的构象发生显并变化，插入靶细胞的细胞膜，在胞膜上的形成孔道，破坏细胞的渗透压平衡，最终造成 核型多角体病毒(nuclearpolyhedrosisvirus，简称NPV)是一类以例技动物门的比虫类动物为宿主的病 毒，其特征是能在被感染细胞的细胞核中产生一个折光性强、包含和保护众多病毒粒子的蛋白质绵品， 即多角体。自然环境中，NPV以包涵体的形式存在，其内包埋望杆状的病毒粒子；当包涵体被比虫吞食 而进入肠道后，在宿主中肠的碱性环境下迅速溶解。暴露出由包涵体病毒包裹的ODV(“包涵体来源型” 肠上皮细胞吸附或者融合，ODV内的核农壳随之进入中肠上皮柱状细胞，完成初级感染；此后，病毒开 始在中肠细胞内复制，产生BV(“出芽型”病毒粒子)，BV很快经过中肠细胞并感染脂肪体、肌细胞、 血腔细胞、上皮细胞等其它组织细胞，形成次级感染，最终导致宿主幼虫液化死亡。在病毒入侵宿土的 胞的主要冈子． 重组蛋白可能在毒力没有发生改变的前提卜．扩人Bt杀虫品体蛋白的杀虫范围，从而可以构建出一种具有 作者绚介：n}。湘漓f l7◆)，男，湖南K沙人，创教授．1[-nlOll：ye_．xl蛳蛐@阳啪哦潮．a 微生物实用技术生态环境应用学术研讨会 广谱杀虫作用的新型Bt?E程菌株。 l材料与方法 1．1材料 a用作亚克隆宿主菌，该菌株不含限制性内切酶和甲基化酶，对氨苄青霉素和四环素敏感；苜蓿丫纹夜 蛾核多角体病毒(AcMNPV)由武汉大学生命科学院提供。 1．2方法 1．2．1 crylAc基因、crylAc基因终止子和p74基因的克隆 ml 200 将Bt4．0718菌株先于LB斜面30(2活化8h，后接于30LB培养基中，30C rpm摇床培养； 当OD值为0．7时，离心收集菌体；用试剂盒提取质粒，-20C保存．以提取的质粒为模板分别PCR扩 增含有上游启动序列的crylAc基因以及含有crylAc基因终止序列的crylAc基因终止子。 以AcMNPV基因组为模板，PCR扩增p74基因(Genebank登录号：L22858)。 1．2．2大肠杆菌感受态细胞的制备 ml ml 挑取人肠杆菌单菌落DH5a于10LB培养基中，37C200rpm培养过夜。以2％接种量转接50 250 min， LB大摇瓶中，37C rpm以上培养l～2h，当ODt,oo值约为0．4时，将培养液丁冰浴中放置10 mol／L)，用 转入预冷人离心管中，6000 4C离心10min：弃上清，加入10ml预冷的CaCl2(0．1 rpm M／15％