抗双链DNA单克隆抗体致狼疮性肾炎的研究论文.pdfVIP

抗双链DNA单克隆抗体致狼疮性肾炎的研究 曹清华 (上海市疾病预防控制中心，上海市中山西路1380号，上海200336) 【摘要】目的研究抗双链DNA(dsDNA)单克隆抗体是否具有诱导狼疮肾炎的致病性。方法以 瘤细胞株；用肾脏免疫组化、免疫荧光和尿蛋白含量检测分析抗体能否诱导狼疮肾炎的发生。结果获 肾小球有IgG类免疫复合物沉积，考马斯亮蓝法检测尿蛋白含量显著升高。结论抗dsDNA单克隆抗体 在系统性红斑狼疮发病中的作用具有重要价值。 【关键词】抗双链DNA抗体；单克隆抗体；肾炎；SLE 系统性红斑狼疮(SEE)是一种严重的自身免疫性疾病，抗dsDNA抗体是SLE的重要的血清学特征…。 有研究表明抗dsDNA抗体具有致病性，可以引起肾炎的发生，但也有研究表明有些患者抗体阳性但无肾 的，其抗原特异性也是多样的口1。杂交瘤技术的应用为研究复杂的DNA抗体群提供了方便。单克隆抗体 由于仅针对某一特定的抗原决定基，具有性质纯、特异性强等特点。为了进一步研究抗dsDNA抗体和疾 病的关系，有必要建立抗dsDNA的杂交瘤细胞株。 目前，常见的制备抗dsDNA单克隆抗体的动物模型主要包括由遗传因素决定的自发性的小鼠，如 x NZB、(NZB×NZW)F1，SWR 的基因组成和免疫学特征，因此，来源于正常小鼠的抗dsDNA单克隆抗体将更有利于抗体致病性的研究。 原活化淋巴细胞的DNA(activated lymphocyte—derived 瘤技术成功建立了l株抗dsDNA的杂交瘤细胞株6C2，并对抗体是否具有致病性进行了鉴定。 1．材料与方法 1．1材料 A、OPD、购于 北京鼎国公司。 1．1．2细胞株小鼠骨髓瘤细胞株SP2／0由本室保存。 一375— 1．1．3实验动物6-8周龄的雌性BALB／c／]、鼠，购自中国科学院上海实验动物中心。 r， 1．2方法 1．2．1抗原ALD—DNA的制备颈椎脱臼法处死小鼠，无菌操作取脾脏，制成单个细胞悬液，用 Tris—NH。C1破坏红细胞，以完全RPMI-1640培养液调细胞浓度为2×107个／ml，加人ConA至终浓度为 考文献H1。实验所用DNA的OD：雠。。的值均在1．8～2．0之间，一20cC保存。 次免疫后10天尾静脉进行冲击免疫，3天后取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0按4：1比例混合，在 克隆按有限稀释法亚克隆3次后，大量扩增并液氮冻存。 PH7．4 lh；用洗涤液(含Tween一20 次，3mird次，空干。加封闭液(含5％羊血清0．05MPH9．6的碳酸盐缓冲液)100“岈L，37℃孵育1h，洗 30％的Hzoz)100ul／孔，37qC15～20min；待 磷酸盐底物缓冲液12．5ml，加双蒸水12．5ml稀释，再加人37p．1 显色后加2MH：SO。509l终止反应，于自动酶标仪490rim处读取A值。 1．2．4单克隆抗体的制备、纯化及纯度鉴定收集扩大培养的单克隆杂交瘤细胞(5×1b5个)注射 小鼠腹部明显肿胀时j处死小鼠，用无菌注射器抽取腹水。3000r／min离心lOmin，+吸上清，用0．229m 分光光度法定量、无菌过滤并分装于一80。C低温保存。抗体纯度鉴定采用SDS—PAGE电泳。 1．2．5单克隆抗体的效价及特异性检测腹水抗体效价用间接ELISA法测定，以SP2／0诱生的腹水 BSA、RNA为抗原包板，按1．2．3间接ELISA法检测单克隆抗体6C2的特异性。 1．2．6杂交瘤细胞注入小鼠的肾脏免疫病理及尿蛋白含量的检测参考文献”将杂交瘤细胞和对照 SP2／0细胞植人降植烷预处理的正常BALB／c小鼠腹腔内，当出现肉眼可见的腹水后3～5天即可处死小 鼠取。肾脏，用干冰急冻，OCT包埋，切成59m的薄片，滴加羊抗鼠IgG—FITC，荧光显微镜下观察肾小 球IgG的沉积。光镜下观察HE染色切片肾小球的病理变化。分