HPLC法测定昆明山海棠中雷公藤甲素含量.docVIP

HPLC法测定昆明山海棠中雷公藤甲素含量 胡建林1，2 敖琳1 宾婕2 杨丽川2 刘昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum (Levl.)Hutch.]系卫矛科(Celastraceae)雷公藤属[Tripterygium Wilfodii(Hook.) f.]植物，用于类风湿性关节炎，红斑狼疮等。昆明山海棠为中国特有植物，民间常用中草药。主要分布于我国西南地区，云南省境内尤为多见，资源丰富[1]。近年来，昆明山海棠有效成分研究多有报道，但其含量测定研究少见。2005年版《中国药典》(一部)示其片剂以重量法进行含量测定，测定方法相对粗糙，检测灵敏度、重现性有待提高。 高效液相色谱法是现今用于测定中草药中有效成分最好的方法之一，本项目应用高效液相色谱法对昆明山海棠中主要有效成分雷公藤甲素的含量测定方法进行研究，以期得到一种适用于昆明山海棠有效成分含量检测及药品质量控制的方法，完成昆明山海棠中主要有效成分雷公藤甲素的含量测定。( 1 仪器、试剂与药材 1.1 仪器：日本岛津LC-2010A HT型HPLC仪（LC-2010型四元泵，SPD-M10A VP型二极管阵列检测器，自动进样器，LC Solution色谱工作站），电子分析天平（德国赛多利斯），TU-1810型紫外-可见分光光度计（上海普析通用），SPE柱（Agilent TC-C18微柱）。 1.2 试剂：甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯，雷公藤甲素标准品（上海标准品生物技术公司 批 含量≥98.0%） 1.3 药材：昆明山海棠生药（购自玉溪药材公司，本院生药学教研室 唐丽萍博士鉴定） 2 方法与结果 2.1 检测波长的选定 雷公藤甲素对照品乙醇溶液，紫外-可见分光光度计200～400nm扫描，最大吸收位置218nm。 2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18柱（4.6×250mm，5μm），流动相：甲醇-水（49﹕51），流速：1ml/min，检测波长：218nm，柱温：30℃，进样量：10μl。雷公藤甲素保留时间：16.80min，对照品及样品色谱图，见图1 A B 图1 对照品（A）样品（B）HPLC色谱图 2.3 对照品储备液的制备 精密称取雷公藤甲素对照品4.4mg，置10ml容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，即得浓度为440μg/ml的雷公藤甲素标准储备液，置冰箱内低温保存，用时稀释为浓度44μg/ml的雷公藤甲素对照液。 2.4 样品处理 取昆明山海棠生药粉25g，精密称定，置250ml锥形瓶中，用乙酸乙酯（120ml、60ml、60ml）回流提取三次（3小时、1小时、1小时），过滤，滤液合并，回收溶剂至适量，过氧化铝柱[2]（15g中性氧化铝、100～200目、干法装柱），250ml乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，转入25ml容量瓶中，甲醇定容，过SPE柱，作为样品溶液。 2.5 线性关系 取浓度44μg/ml的雷公藤甲素对照液，上述色谱条件下，分别进样1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl测定，记录峰面积。以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，回归方程为Y﹦103457X﹢5904.2，相关系数r﹦0.9996（n﹦6），表明雷公藤甲素含量在0.044～1.1μg/ml范围内线性良好。 2.6 精密度试验 取浓度44μg/ml的雷公藤甲素对照液10μl，上述色谱条件下，连续进样5次，RSD为2.56%，表明精密度良好。 2.7 稳定性试验 取浓度44μg/ml的雷公藤甲素对照液，上述色谱条件下，8小时内每隔1小时取10μl进样，共8次，RSD为2.63%。 2.8 加标回收率试验 取昆明山海棠生药粉1g，共五份，精密称定，各加入44μg/ml的雷公藤甲素对照液1.0ml，按样品处理方法制备待测液，上述色谱条件下，分别进样，每次10μl，测定雷公藤甲素含量，见表1，平均回收率93.2％，RSD为1.97%。 表1 加标回收率试验 取样量（g） 含量（μg） 加标量（μg） 峰面积 实测量（μg） 回收率（％） 1.0158 38.54 44 87088 76.93 93.2 1.2525 47.52 44 95420 84.29 92.1 1.1439 43.40 44 93099 82.24 94.1 1.2638 47.80 44 99349 87.76 95.3 1.0076 38.23 44 84518 74.66 90.8 2.9 样品含量测定 精密称取昆明山海棠生药粉24.9456g，按“2.4”项下方法制备样品溶液，上述色谱条件下，分别进样3次，