生物分离工程 第七章 色谱技术.ppt

生物工程下游技术 第七章 色谱技术 目的和要求 了解色谱原理，掌握各种常用色谱方法的操作与应用 。 目录 色谱原理与分类 色谱过程理论模型 分离度 凝胶过滤色谱 离子交换色谱 疏水性相互作用色谱 流通色谱 本章主要知识点 什么是色谱分离技术？ 色谱分离技术的分类 什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？ 吸附色谱及其分类和基本原理 什么是分配色谱？ 离子交换色谱的分类及应用 凝胶色谱的分离原理及分类 离子交换及疏水作用层析的原理 高效液相色谱的分离原理及应用 蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？ 色谱技术（分配色谱） 概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 一、色谱原理与分类－学习要点 识记：色谱方法分类 理解：色谱原理 1、定义（chromatograph） 定义 色谱是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间分配行为的差别而引起移动速度的不同而进行分离的方法。 2、原理 色谱操作中互不混溶的两相分别称为固定相和流动相。固定相填充于柱内形成固定床，在柱的入口端加入料液后，连续输入流动相，料液中溶质在流动相与固定相之间扩散传质，产生分配平衡 3、色谱分离方法的分类 色谱分离方法很多，种类有四、五十种，但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分以下几种： 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 （1）流动相分类 气相色谱 液相色谱 超临界色谱 （2）固相分类 类型 分配色谱（固定相为液相） 吸附色谱（固定相为固相） 形状 纸色谱 薄层色谱 柱色谱 （3）操作压力分类 低压液相色谱（0.5 MPa） 中压液相色谱（0.5-4.0 MPa） 高压液相色谱（4.0 MPa） （4）流动相流动方式分类 轴向流色谱 （5）分离操作方式分类 洗脱色谱 迎头色谱 顶替展开 （6）机理分类 凝胶过滤色谱 离子交换色谱 反相色谱 疏水性相互作用色谱 亲和色谱 4、色谱分离原理 分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd分配系数 q、c溶质在固相和液相中的浓度 阻滞因子Rt 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小 洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异 塔板理论 马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出塔板理论，将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板（theoretical plate），一个理论塔板的长度称为理论塔板高度（theoretical plate height）H。 经过多次分配平衡，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。 色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N理论塔板数 tR保留时间 W1/2半峰宽 Wb峰底宽度 理论塔板高度：L柱长 5、分离度 识记：分离度的概念 理解：如何分离度判断两个相邻洗脱峰的分离程度 （1）定义及表述 定义 分离度又称分辨率，是表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度 分离度的表达 Gauss洗脱曲线的分离度 （2）分离度的其它表征方法 容量因子 容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比，用k’表示 选择性 选择性为洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比 6、凝胶过滤色谱－学习要点 理解：凝胶过滤的原理和操作，凝胶过滤介质的要求和影响分离特性的因素 应用：掌握凝胶色谱的应用及特点 （1）定义 凝胶过滤色谱利用凝胶粒子为固定相，是根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相色谱法 （2）原理 在GFC柱中，分子量大的溶质不能进入凝胶介质，而沿介质空隙流过 分子量很小的溶质能够进入所有的细孔中，其洗脱体积接近柱体积 分子两介于两者之间的溶质能够进入部分细孔中 （3）分配系数 凝胶过滤色谱的分配系数可用下式表示 GFC的分配系数在0～1之间，分离精度有限。 （4）影响分配系数因素 相对