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基因工程的基本知识 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，在特定部位的磷酸二酯键处切割，因此具有专一性。 （3）结果：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,本质是双链环状DNA分子（质DNA）。 （3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程：第一步（变性）：加热至90～95℃DNA解链；第二步（复性）：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步（延伸）：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 （3）条件：引物、模板、酶、原料、能量、适宜的温度和PH值 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞 ，再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 目的基因成功插入的基础：①遵循碱基互补配对原则；②粘性末端相同； ③具有相同的化学结构 第四步：目的基因的检测和表达 1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。 2.其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。 3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。 4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 目的基因成功表达的基础：具有一套相同的遗传密码。 （三）基因工程的应用 1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。 3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。 4.微生物在基因工程领域中的重要作用： ①工具酶主要来自微生物； ②最重要的目的基因供体库之一； ③目的基因的载体之一； ④作为受体细胞； ⑤提供用于发酵的工程菌 （四）蛋白质工程——第二代基因工程 1.与基因工程合成的蛋白质的主要区别是　基因工程只能合成自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程可合成一些自然界中原本不存在的蛋白质　。 2.蛋白质工程的基本途径中　预期蛋白质功能　→　设计蛋白质结构　→　推测氨基酸序列　→　找出对应的脱氧核苷酸序列　。 2