实验五基因表达的整胚原位杂交分析.docVIP

实验五 基因表达的整胚原位杂交分析 一、实验目的：在胚胎发育过程中基因都是按严格的时空模式进行表达。本次实验以斑马鱼脊索中胚层标记基因ntl为例，进行整胚原位杂交分析其在斑马鱼胚胎原肠期的空间表达模式。 二、mRNA原位杂交的原理：RNA原位杂交是运用cDNA或寡核苷酸等探针检测细胞、组织和胚胎内目标基因mRNA表达的一种原位杂交技术，它能够将目标基因在胚胎上表达的部位直观而明确的展现出来。其基本原理是：在胚胎细胞和组织结构保持不变的条件下，用与目标基因mRNA互补并连接了地高辛等标记物的反义序列作为探针，在胚胎上与待测目标基因的mRNA结合而形成杂交体（Hybrids）；然后再用标记物的识别抗体，通过组织化学或免疫组织化学方法在形成杂交体的位置形成可在显微镜下观察到的杂交信号，从而确定目标基因的空间表达模式。 三、实验器材和材料： 1、实验器材：体视显微镜，28.5℃恒温水浴设备，恒温水浴锅，PH值测定仪，斑马鱼养殖设备（加热棒，曝气设备），分子杂交炉，真空泵，水平摇床等。培养皿（中号，大号各5组），胶头滴管若干，移液枪，2ml 离心管（无DNase/RNase）,锡箔纸等。 2、溶液配制： （1）1×PBS；（2）0.25%胰蛋白酶；（3）1×Hanks液 （4）4%PFA(wt/vol):称取20g多聚甲醛(paraformaldehyde PFA)溶于经DEPC处理的500ml 1×PBS溶液，65℃水浴加热，持续搅拌至溶液澄清，冷却至室温，冰上过滤、分装，-20℃放置。 （5）PTW: 1×PBS,0.1%Tween-20(vol/vol)。 （6）20×SSC:购自上海生工，4℃放置备用 （7）10%CHAPS: 5g CHAPS粉末（上海生工）溶于50ml RNase-free 双蒸水中，分装，-20℃放置。 （8） 100mg/ml Heparin: 称取100mg Heparin（上海生工）溶解于1ml RNase-free 双蒸水中。 （9）10mg/ml Yeast tRNA : 称取2 mg Yeast tRNA(Roche)溶于2 ml RNase-free 双蒸水，分装，-20℃放置。 （10） 10% Tween-20（vol/vol）） mM EDTA, 0.2% Tween-20，100μg/ml Heparin, 50μg/ml Yeast tRNA。 （15） Blocking Buffer：1×PBS，2% Sheep Serum，2 mg/ml BSA，0.8% GoatSerum，0.1% Tween-20(vol/vol)。 （16） Staining Buffer：100 mM Tris-HCl(pH 9.5),50 mM MgCl2,100 mM NaCl,0.1% Tween-20(vol/vol)。 3、杂交用RNA探针的制备： 用位于插入片段5’端的限制性内切酶对已构建好的重组载体pB-zf ntl ORF进行单酶切，轻轻混匀后置于37℃水浴酶切4h后，取1μl点样，检测是否酶切完全，然后使用PCR纯化试剂盒(Axygen)回收线性质粒。 以线性化的重组载体为模板，采用Roche公司的体外转录试剂盒转录得到地高辛（DIG）标记的反义RNA探针。37℃水浴反应2h，加入DNase I消化质粒模板，37℃孵育15-20分钟。将上述反应体系用Roche公司的Mini Quick Spin RNA Columns进行纯化。最后将得到的ntl探针进行电泳检测，加入等体积的去离子甲酰胺，测定浓度，-80℃保存。 四、实验步骤： 斑马鱼胚胎的获得： 参照实验六 斑马鱼胚胎受精膜的去除：参照实验六 胚胎材料的收集： 体视镜下观察斑马鱼胚胎发育情况，发育时期的确定参照Kimmel[1]的划分标准，取原肠中晚期（70-90%下包）胚胎进行实验。用大口径吸管选取30颗左右的胚胎置于装有4%PFA的EP管中，4℃固定过夜。 斑马鱼胚胎整胚原位杂交 整胚原位杂交按照Thiss的方法[2]进行。具体步骤包括胚胎固定和预处理、复水和杂交、洗脱和孵育抗体以及显色等。 （1）胚胎的预处理 (a) PFA固定后的胚胎，用PTW溶液漂洗2次，5min/次。 (b) 脱水。使胚胎依次经过25%，50%，75%，100%的甲醇/PTW溶液，5min/次。然后100%甲醇洗3次，10min/次。 (c) 将胚胎置于新鲜的100%甲醇，-20℃保存。可放置数个月。 (2) 复水和杂交 （以下溶液若无确切说明，每次用量为1ml）(a) 复水，即将100%甲醇依次置换成75%，50%，25%的甲醇/PTW溶液，5min/次，然后用PTW溶液洗2次，5min/次,室温进行。 （b）PTW/HYM（1：1）混合液洗涤胚胎