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实验十四 还原糖和总糖含量的测定 （3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、目的 植物体内的还原糖，主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是呼吸作用的基质。还原糖还能形成其他物质如有机酸等；此外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用，其他碳水化合物，如淀粉、蔗糖等，经水解也生成还原糖。通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作，熟悉分光光度计的使用方法。 二、原理 各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。 在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）刻度试管：25ml （2）离心管或玻璃漏斗2个 （3）烧杯： 100ml 1个 （4）三角瓶： 100ml 1个 （5）容量瓶：100ml 3个 （6）刻度吸管：lml 1个，2ml 4个，10mI 1个 （7）恒温水浴 （8）沸水浴 （9）离心机（过滤法不用此设备） （10）电子天平 （11）分光光度计 2．试剂 （1）lmg／ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在 80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和 262ml 2mol／L NaOH溶液，加到 500ml含有 185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g结晶酚和 5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定客至1000ml，贮于棕色瓶中备用。 （3）碘一碘化钾溶液：称取sg碘和109碘化钾，溶于100ml蒸馏水中。 （4）酚酞指示剂：称取 0.1g酚酞，溶于250ml 70％乙醇中。 （5）6mol／L HCl。 （6）6mol／L NaOH。 3．材料 食用面粉。 四、操作步骤 1．制作葡萄糖标准曲线 取7支25ml刻度试管，编号，按下表操作。 操作项目 管 号 0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水(ml) 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 3,5-二硝基水扬酸(ml) 各1.5 将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml，混匀。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 2．样品中还原糖和总精含量的测定 （1）样品中还原糖的提取：准确称取3g食用面粉，放在100ml三角瓶中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加 50ml蒸馏水，搅匀，置于 50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用20ml蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。 （2）样品中总糖的水解和提取：准确称取1g食用面粉，放在100ml的三角瓶中，加入 10ml 6mol／L HCI及 15ml蒸馏水，置于沸水浴中加热水解 30min。取 1—2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘一碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入 1滴酚酞指示剂，以 6mol／L NaOH中和至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取10ml定容过的水解液，移入另一100ml的容量瓶中，以水稀释定容，混匀，作为总糖待测液。 （3）显色和比色，取4支25ml刻度试管，编号，按下表所示的量操作。 管 号 还原糖测定管号 总糖测定管号 （1） （2） I II 还原糖待测液（ml）