灰霉AUR1基因的必需性分析.pptVIP

灰霉AUR1基因的必需性分析 黑曲霉pepB基因缺失菌株的构建 以黑曲霉基因组 D N A为模板，用PCR方法分别扩增pepB基因中的上游约1.4kb和下游约1.3kb两段DNA序列，将此两段序列按同一方向分别插入质粒pMW1中潮霉素抗性基因(hph)表达单元的5’和3’端， 构建成重组质粒pMW1—pepB，用于通过同源重组靶向破坏基因组中的pepB基因。 1、P CR引物设计和扩增反应  根据pepB全基因序列设计两对引物 P1/P2和T1/ T2。 在P1和P2中分别引入限制性酶切位点Hpa1和Sal 1，T1和 T2 中分别引入限制性酶切位点BamH 1和 Hpa1。以黑曲霉染色体DNA为模板，使用上述两对引物分别 PCR扩增pepB基因中的上游(以后简称为P端)序列与下游(以后简称为T端 )序列。 pepB基因阻断质粒的构建 PCR产物P端先用T4DNA聚合酶削平，再用Sal1酶切,载体pMW1先用HindIII酶切，Klenow补平后再用Sal1酶切。将处理后的P端克隆到上述载体，得到pMW1-P。 PCR产物 T端同样用T4DNA聚合酶削平，克隆到pMW1-P的Sma I位点。获得含pepB阻断基因的pMW1-pepB (图1) ，分别用Pst1和EcoR1，Sal 1和BamH 1双酶切，Hpa