多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性研究).docVIP

中山大学 博士后学位论文 多糖衍生物用于蛋白质复性及天然胶乳改性的研究 姓名：陈继平 申请学位级别：博士后 专业：高分子化学与物理 指导教师：张黎明摘 要 环糊精和温敏聚合物聚．异丙基丙烯酰胺）（ＰＮＩＰＡ）对蛋白质的复性均有良 好的促进作用，那么经ＰＮＩＰＡ改性后的环糊精衍生物能否更有效促进变性蛋白 质的复性呢？为此，我们将氨基．１３．环糊精（ＥＤＡ．１３一ＣＤ）和带末端羧基的聚Ｎ一 异丙基丙烯酰胺（ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ）偶联得到了一种温敏Ｂ一环糊精衍生物 （１３．ＣＤ．ＰＮｍＡ），分别考察其在不同变性体系、不同１３－ＣＤ。ＰＮＩＰＡ浓度、不同复性 温度以及在表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）存在下对溶菌酶的复性 效果；通过与ＥＤＡ．１３．ＣＤ和ＰＮＩＰＡ—ＣＯＯＨ的对比分析，揭示了１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ分 子中的环糊精空腔与ＰＮＩＰＡ链段的协同作用，并使用荧光光谱法进行了验证。 实验结果表明：ｐ．ＣＤ—ＰＮＩＰＡ对盐酸胍变性溶菌酶的复性具有抑制作用，但对尿 素变性溶菌酶的复性具有促进作用；在常温下，０．４ｍｇ／ｍＬ的ＩＢ－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ可使ｌ ｍｇ／ｍＬ溶菌酶的复性率增加至８３．７％，而直接稀释法仅为５５．８％；１３－ＣＤ．ＰＮＩＰＡ 对溶菌酶的复性温度应略小于１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ的相转变温度（ＬＣＳＴ，３３．６。Ｃ）， 高于这一温度时会由于ｐ．ＣＤ．ＰＮＩＰＡ发生相变而导致溶菌酶的复性率急剧降低； 将１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ在ＣＴＡＢ辅助溶菌酶复性一段时间（如１２ｈ）后再加入到复性体 系，溶菌酶的复性效果更佳。在辅助溶菌酶复性的过程中，１３－ＣＤ—ＰＮＩＰＡ分子中 的环糊精空腔与ＰＮＩＰＡ链段可以同时促进溶菌酶的复性，荧光光谱实验结果证实了这～结论。 针对天然乳胶（ＮＲＬ）ＩｔｉｌＪ品蛋白质过敏及乳胶制品的生物降解问题，考察了海 藻酸钠、透明质酸及羧甲基纤维素的氧化产物氧化海藻酸钠（ＯＳＡ）、氧化透明 质酸（ＯＨＡ）和氧化羧甲基纤维素（ＯＣＭＣ）对天然胶乳中的蛋白质的固定作 用，对比了这三种氧化多糖对乳胶蛋白质的固定效果，分析了加入氧化多糖后蛋 白质在乳胶膜中的分布情况，讨论了氧化多糖含量以及氧化多糖分子中的醛基含 量对乳胶膜的力学性能、热降解及生物降解过程的影响。实验结果显示，三种氧 化多糖对天然乳胶中蛋白质都具有很好的固定作用；以ＯＳＡ为研究对象表明，乳 胶膜中ＯＳＡ含量越多，乳胶膜中水溶性蛋白质（ＷＳＰ）析出率越低，当ＯＳＡ占干 乳胶的１．６７ ｗｔ％时，乳胶膜ＷＳＰ的溶出率即趋近于０；ＯＳＡ中醛基含量越多，ＷＳＰ 溶出率越低，当ＯＳＡ醛基含量为４．８ ｍｍｏｌ／ｇ时，仅用０．３３ ｗｔ％（以固含量计）的 ＯＳＡｔｉＰ可使乳胶膜中形孓晰出率低于５０｝ｌ眈。未加ＯＳＡ的乳胶膜在土埋２５天后的质量损失率为５叭％左右，之后质量不再发生明显改变；而含有ＯＳＡ的乳胶膜在 土埋２５天后质量继续下降，其质量损失率超过乳胶中非橡胶成份所占的百分率， 且ＯＳＡ用量越大，乳胶膜的质量损失率越大。同时，氧化多糖对乳胶膜的力学性能无明显的影响。 关键词：ｐ一环糊精，聚（Ｎ一异丙基丙烯酰胺），溶菌酶，复性，天然胶乳，多 糖衍生物，蛋白质固定，降解 第一章 温敏ｐ．环糊精衍生物用于蛋白质复性的研究 １．１引言由于环糊精分子中含有疏水性空腔，客体分子能从宽口端进入其分子空腔形 成包络化合物。因此在使用表面活性剂辅助蛋白质复性时，常常需要加入环糊精 以剥离与蛋白质形成胶束的表面活性剂或去污剂【１‘３１。Ｋａｎｌｐｐｉａｈ等人【４１发现，向 盐酸胍变性的碳酸脱水酶（ＣＡＢ）复性稀释液中加入适量ｐ一环糊精（Ｄ．ＣＤ）可使其复 性率超过９０％。他们认为这是由于环糊精的疏水性空腔与蛋白质复性中间体的疏 水性位点发生了相互作用。 聚烈．异丙基丙烯酰胺）（ＰＮＩＰＡ）是一种具有温度敏感性的聚合物，在一定温 度下能发生亲水／疏水（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｅ—ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）ｎ－Ｉ逆转变，在水溶液中表现为一 种可逆的溶解／沉淀行为【５１（在凝胶中则表现为一种可逆的溶胀／收缩行为【６】）。发生这一转变时的温度即为相转变温度（Ｌｏｗｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ＬＣＳＴ），而ＰＮＩＰＡ水溶液的ＬＣＳＴ在３２附近〔７，８Ｊ。ＰＮＩＰＡ曾被用于蛋白质的复性 研究【９－１¨。如Ｌｉｎ等人【１０ｌ将ＰＮＩＰＡ用于辅助ｐ．１ａｃｔａｍａｓｅ的复性，发现其复性效率比ＰＥＧ更高，使用ＰＮＩＰＡ可使经盐酸胍变性的１３一ｌａｃｔａｍａｓｅ的活性率提高４ｌ％，而 ＰＥＧ只能提高２６％。Ｌｕ等人【１１】曾采用ＳＤＳ－－ＰＡＧＥ，圆二色谱和荧光光谱等方法研 究了ＰＮＩＰＡ对尿素变性溶菌酶的复性机理，认为ＰＮＩＰＡ对溶菌酶的复性作用是因 为Ｐ