生物反应工程实验讲义.docVIP

《生物反应工程》实验讲义及实验报告 班级： 学号： 姓名： 成绩： 实验一 游离酶与固定化酶酶学性质比较 实验目的： 掌握测定酶动力学参数的实验方法，作图法计算酶动力学参数，掌握固定化酶的方法，以及固定化酶后动力学参数的变化。 实验原理： 要建立一个完整的酶动力学方程，必须要通过动力学实验确定其动力学参数。对M—M方程，就是要确定rmax和Km值。但直接应用M—M方程求取动力学参数所遇到的主要困难在于该方程为一非线性方程。为此常将该方程加以线性化，通过作图法直接求取动力学参数。通常有下述几种作图方法。 Lineweaver—Burk法 简称L-B法 。将M—M方程取其倒数得到下式： 1 以1／rs对1／Cs作图可得一直线，该直线斜率为Km／rmax，直线与纵轴交于1／rmax，与横轴交于一1／Km。此法又称双倒数图解法。 Hanes—Woo1f法 简称H—W法 。将式 1 两边均乘以Cs得到 2 以Cs／rs对Cs作图，得一斜率为1／rmax的直线，直线与纵轴交点为Km／rmax，与横轴交点为一Km。 3 Eadie—Hofstee法 简称E-H法 。将M—M方程重排为 （3） 以rs对rs／Cs作图，得一斜率为一Km的直线，它与纵铀交点为rmax，与横轴交点为rmax／Km。 固定化酶亦称固相酶或水不溶酶。它是通过物理或化学的方法使溶液酶转变为在一定的空间内其运动受到完全约束、或受到局部约束的一种不溶于水，但仍具活性的酶。它能以固相状态作用于底物进行催比反应。 固定化酶的主要优点是，在催化反应以后很容易从反应系统中分离出来，不仅固定化酶可以反复使用，而且产物不受污染容易精制，固定化后的酶大多数情况下其稳定性增加，仅有少数的稳定性下降，固定化酶有一定的形状和一定的机械强度，可以装填在反应器中长期使用，便于实现生产连续化和自动化。固定化酶的制备方法可分为吸附法、交联法、共价法、包埋法四大类。 如果固定化酶的动力学仍服从M—M方程，则可通过动力学参数Km与rmax值的大小来反映酶在固定化前后活性的变化。 仪器与试剂： 分光光度计、水浴锅、酸性磷酸酯酶、磷酸苯二钠、酚标准液、碳酸钠溶液、费林－酚试剂、卡拉胶 实验步骤及数据记录： 1、酚标准曲线的绘制。取9只试管，按照0-8的顺序编号，0号为空白管。按照下表的过程进行操作： 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0.4mmol/L酚标准液 0 mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 蒸馏水 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 1mol/L碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 2 2 费林－酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 35℃显色10min A680 2、酶动力学参数的求取。取7只试管，按照0-6的顺序编号，0号为空白管。按照下表的过程进行操作：℃ 管号 0 1 2 3 4 5 6 5mmol/L磷酸苯二钠溶液 0 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2mol/LpH5.6乙酸盐缓冲液 0.5 0.4 0.45 0.3 0.2 0.1 0 酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 35℃反应15min 1mol/L碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 费林－酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 35℃显色10min A680 3、酶固定化及动力学参数测定。称取0.8g卡拉胶，溶解在20mL水中，加热煮沸，冷却到50-60℃。将在水浴锅中保温好的酶液5mL倒入，并搅拌均匀，冷却，待完全固化后，用5%的KCl溶液浸泡30 min。将浸泡好的固定化酶取出，滤纸吸干，用小刀将其切成3×3mm的小块。称取固定化酶5g共6份，取6只50mL三角瓶，按照下表过程操作： 三角瓶号 0 1 2 3 4 5 5mmol/L磷酸苯二钠溶液 0 1 3 5 7 9 0.2mol/LpH5.6乙酸盐缓冲液 10 9 7 5 3 1 固定化酶 5 5 5 5 5 5 35℃摇床反应15min 1mol/L碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 费林－酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 35℃显色10min A680 实验结果处理分析： 绘制酚标准曲线 计算游离酶动力学参数 Cs A680 酚含量 rs