S_腺苷甲硫氨酸合成酶组成型表达_产物纯化及鉴定.pdfVIP

中国生物工程杂志 　Ch ina B iotechno logy, 20 10 , 30 ( 3) : 6 166 S腺苷甲硫氨酸合成酶的组成型表达 、 产物纯化及鉴定 田林奇 　牛卫宁 　左晓佳 　钦传光 (西北工业大学生命科学院　西安 　710072) ( ) ( ) 摘要 　将大肠杆菌 E. coli K12 S腺苷甲硫氨酸合成酶 SAM S 基因克隆至质粒 pBR322 中 ,获 得的重组质粒 pBR322 SAM S转入大肠杆菌 JM 109菌株 ,构建了能高效组成型表达 SAM S的重组 菌 E. coli JM 109 (pBR322 SAM S) 。将重组大肠杆菌破碎后上清液经 20% ～40%硫酸铵分级盐 析 、PhenylSep haro se Fa st F low 疏水层析和 Q Sep haro se Fa st F low 离子交换层析 , 即可得到纯度提 高 5倍 , 比活为 48. 7 μ/m g的 SAM S,三步纯化的总回收率为 62 % ,纯度达到 92 % 。SAM S表达量 为 1 176μ/L , 占到菌体可溶性总蛋白的 20% 。重组酶的最适反应 pH 为 8. 5, 4 ℃下在 pH 7. 5 的 缓冲液中保温 10h酶活性几乎不改变 。重组酶反应的最适温度为 55 ℃ ,酶活性稳定的温度范围 为 20 ～35 ℃。重组酶的 KmL M et为 0. 22mmo l/L , Vm ax L M et为 1. 07mmo l/ (L ·h ) , Km A TP为 0. 52 mmo l/L , Vm ax A TP为 1. 05 mmo l/ ( L ·h) 。 关键词 　S腺苷甲硫氨酸合成酶 　大肠杆菌 　组成型表达 　纯化 　酶学性质 中图分类号 　TQ426. 97 　　 S腺 苷 甲硫 氨 酸 合 成 酶 ( Sadeno sylm eth ion im e 生产成本较低 , 因而是较为有 效 的工业 化 生 产 方 ) [ 810 ] syntheta se, SAM S 是存在于多种生物体内的一种酶 , 能 法 。酶促转化法制备 SAM 的酶源主要来 自大肠杆 够催化 L 甲硫氨酸和 A TP 生成腺苷 甲硫氨酸 ( S 菌和酵母 SAM S,大肠杆菌 SAM S和酵母 SAM S相比具 adeno sylm eth ion im e, SAM ) 。在欧洲 SAM 已作为药物广 有底物亲和力高 、反应时间短 、底物转化率高以及产物 泛用于肝病 、抑郁症 、关节炎等疾病的治疗 ,在美国已 终浓度高等优点 [ 11 ] 。因此 , 来源于大肠杆菌的 SAM S 经成为一种畅销的保健品[ 13 ] 。我国 SAM 的开发尚处 是催化合成 SAM 的理想酶源 。但 SAM S在野生大肠杆 于起步阶段 ,市场需求在不断增长 ,但至今为止国内还 菌中含量少 , 活性不高 , 而且分离纯化困难 。因此 , 构 没有企业被批准生产 SAM 相关药物 , 国内用药全部依 建能高效表达大肠杆菌 SAM S 的工程菌并对重组酶进 赖进口,售价昂贵 。因此 ,对 SAM 制备方法的研究具有 行纯化和性质鉴定是酶促转化法大规模制备 SAM 的关 十分重要的意义 。 键问题 。 　　目前 , SAM 的工业化生产主要是酿酒酵母以及重 　　研究构建了能高效组成型表达大肠杆菌 SAM S 的 组毕赤酵母发酵法 ,但存在着生产周期长 、底物转化率