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应用Biacore 3000 系统进行配体垂钓 摘要 近年来，多个研究小组都相继发表了Biacore 的SPR 技术在蛋白质组 研究领域中的应用，尤其是对重要蛋白的配体垂钓并结合质谱技术 对与重要蛋白相结合的配体识别的应用特别引人注目。有两种主要 的实验方法：用质谱对结合在芯片表面的蛋白直接检测；微量回收 结合的蛋白后再检测。在此，我们将报告一个从复杂生物混合物中 进行配体垂钓再结合质谱技术对能特异性结合的配体进行识别的实 验。与很多已发表的文献中的方法不同的是，这个方法没有对现有 的Biacore 3000 进行任何硬件和软件的修改。 导言 钙调蛋白（CaM ）是真核细胞中普遍存在的钙离子结合蛋白，是细 胞反应的主要生理效应器之一。钙-钙调蛋白参与了胞内钙平衡的维 持，同时调节了胞内第二信使的浓度如AMP 和肌醇磷酸盐的循环。 这些信使参与了核蛋白转入的活化，从而建立了信号传导和核运输 的关联。 上图（Fig1 ）显示了一个载有钙离子的钙调蛋白与肌球蛋白轻链激 酶的肽片段结合，这是与钙调蛋白有生理作用的其中一个酶。被显 示的部分是13 个氨基酸长的肽片段，其结果摘自 Meador et al., PDB ID code 1CDL. 在我们的实验体系中26-巯基的M13 肽被耦连到CM5 芯片表面，用来选择性的从标准的CaM 溶液和牛脑粗提液中捕获 CaM 。 Figure1 载有钙离子的钙调蛋白与 肌球蛋白轻链激酶的肽片 段结合 材料和方法 材料 微量回收钙调蛋白标准品 实验在Biacore 3000 上进行，实验温度 将60 μl ， 50 μg/ml 的钙调蛋白 25 ℃。以补充了2mM CaCl2 的HBS-N 加到耦连了M13 肽片段的芯片 缓冲液作为流动缓冲液。M13 肽片段是 表面，进样速度10 μl/min 。待 用户用MedProbe (Oslo,Norway) 自行合 结合过程达到平衡时，停止进样 成的，并用氨基耦连的方法耦连到 并用70%的蚁酸清洗针头一次， CM5 芯片的4 个通道上。牛脑钙调蛋白 再用流动缓冲液清洗针头两次。 标准品购自Calbiochem (La Jolla, CA), 接着进行BYPASSWASH 步 牛脑粗提液来自Sigma (Stockholm, 骤：以50mM 的NaOH 为洗液 1，10mM HEPES 为洗液2 及 10 Sweden)。 Figure2. μmCaCl2 为洗液3 。回收后的清 钙调蛋白标准品的结合和回收传感图 洗也用洗液3 。从传感图 （Fig2 ）上看出每个通道内约 2.5ng （1000RU 约合1ng 蛋白） 的钙调蛋白被结合了，相当于有