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单细胞凝胶电泳图像分析系统改进 中文摘要 实验目的 鉴于目前彗星试验图像分析软件存在的种种问题与不足，如它对于分 析结果无法进行必要的人为校正、对于高度损伤的细胞可能分析错误、程 序鲁棒性较差、内部文档不足、不易操作等，本课题在Helma等人的宏 程序基础上进行了改进，着重解决高度损伤细胞的分析不准确甚至完全错 误的问题，同时增加手动校正功能，以尽可能保证试验结果的真实性、准 确性，并完善了该宏的容错性能与内外部文档，提高其鲁棒性，使用户更 易操作。 实验方法 在对图像分析错误的改进中，本研究采用了以梯度阈值为基础的综合 性彗星头中心点确定方法，代替原来计算彗星头中心的固定阈值(80％) 方法。本研究还增加了对分析错误的数据进行人为校正的功能，由操作者 重新指定正确的彗星头中心，从而把错误数据纠正为正确数据，并入统计 分析。在容错性能的改善上，本研究在所有可能被用户调用的宏过程的开 始处均加入了错误检查和异常处理程序段，可以暂停程序执行并给出正确 的操作方法说明。同时，本研究应用改进后软件进行标准彗星试验检测， 不同时间的孵育，获得不同损伤级别的细胞，并以改进后的软件进行分析。 比较改进前后的尾长、尾矩、尾DNA百分含量上的差异、改进前后分析 正确率差异、以及改进后的软件以不同DNA损伤级别为截断值判定阳性 结果的灵敏度、特异度、Youden指数、粗一致性、调整一致性、阳性预 测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比。 实验结果 改进后的软件对于原软件分析错误的图像在大多数情况下都可以正 确分析，同时拥有了错误数据的人工校正功能，程序鲁棒性有所增强，更 加方便易用。对于0～2级损伤的彗星细胞来说，原软件与改进后的软件 在尾长、尾矩、尾DNA百分含量上的分析具有统计学非常显著意义，但 实际差别量不大，没有实际生物学意义；而对3～4级损伤的彗星细胞来 说，改进后的软件比原软件在统计学上更加接近真值，且实际差别量足够 大，同时具有统计学非常显著意义和生物学意义；改进后的软件对于1 级及1级以上彗星细胞的判定来说，灵敏度97．70％、特异度67．42％、 进后的软件对于2级及2级以上彗星细胞的判定来说，灵敏度95．38％、 0．05。 结 论 彗星试验图像分析软件经改进后，分析准确性得到提高，程序鲁棒性 增强，而且易用性改善，并增加了由操作者进行必要校正的功能；所得分 析结果与人为指定的分析结果相比，并不同时存在统计学显著差异和生物 学显著差异，可作为真实可靠的彗星数据分析系统应用；改进后的系统在 拖尾细胞判定上具有很高灵敏度，可用于筛查试验项目；在2级及2级以 上损伤细胞的判定上同时具有较高的灵敏度和特异度，是实验室研究中的 优良指标。 关键词：单细胞凝胶电泳；图像分析；DNA损伤；遗传毒理 ·2· OnAn Improvements ForComet Image Analysis System Assay ABSTRACT ectives obj Tosolvethe of orinaccurateof problem wrong analyses severely