超氧化物歧化酶的活性测定.docVIP

超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide?dismutase，简称?SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(O2?-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2?-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。 按金属辅基成分的不同可分成3种类型。最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。 [原理] SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2?-，利用SOD分解而间接推算酶活力。在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。Cyte还原法用于Mn-SOD活力测定结果稳定，重复性好。但专一性和灵敏度不够理想，而且需要特殊仪器，实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与CN—抑制剂或SDS处理相结合，应用于Mn-SOD测定，灵敏度比Cyte还原法提高数倍，而且专一性强，重复性好，操作方便，不需要特殊仪器和设备，易于实际应用和推广，是目前较好的测定方法之一。 在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2?-，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。当有SOD存在时，由于它能催化O2?-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。 酶活力单位定义：在25恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。 ?[试剂和器材] 1、试剂 （1）pH8.2、50mmol/L?Tris-HCl称取Tris?0.61g，EDTA-2Na?0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH?=8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。 （2）10mmol/L?HCl （3）50?mmol/L邻苯三酚称取邻苯三酚0.063g，用10mmol/L?HCl溶液溶解，定容至10mL，避光保存。 （4）SOD样液 2、器材 恒温水浴槽 紫外分光光度计试管、刻度吸管、微量注射器 [方法和步骤] ?1、邻苯三酚自氧化速率的测定 取两支试管按下表加入25预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L?HCl代替邻苯三酚?），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07（可增减邻苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。 试剂 空白管（mL） 自氧化管（mL） pH8.2、50mmol/LTris-HCl 4.5 10mmol/L HCl 0.01 - 预热45 mmol/L邻苯三酚 - 0.01 2、SOD样液的活性测定样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。 试剂 空白管（mL） 样品管（mL） pH8.2、50mmol/LTris-HCl 4