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蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程 丁香园chrispp作品。一、证明目的蛋白有表达1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体 LB培养基中37，250rpm培养过夜。2、将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的100mL液体LB 中，37，250rpm，3.5h（大量培养至OD600＝0.6左右）。3、取出1 mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续振荡培养4h。4、以未诱导菌液与IPTG诱导后菌 液作对比，SDS检测。结果如下：图11: pET-32aA3未诱导，2: pET-32aA3未诱导，3: pET-32aA3诱导后，4: pET-32aA3诱导后二、表达的情况，是可溶还是沉淀1、将上述的37诱导菌液离心（4，12000g，5min），弃 上清（LB培养液），沉淀重悬于0.9% NaCl溶液洗菌。2、将重悬于0.9% NaCl的菌体溶液离心（4，12000g，5min），弃上清（0.9% NaCl洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH 7.0）缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL的菌液终浓度。3、超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：400W， 工作：15s， 间隔：45s， 全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据（少量菌液用液氮反复冻融7次以上效果也不错，而且简单，但是DNA出来后会粘稠， 可能加dna酶后会好些，那样好离心，我是用接近最高转速离心的（没加dan酶），不然分不开）4、将超声波破碎的菌液离心 （4，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL 2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS检测。结 果如下：图21: pET-32aA3诱导上清，2: pET-32aA3诱导沉淀三、探索可溶表达条件有 上述实验结果可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很 高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。影 响包涵体形成的因素有很多，如诱导温度，诱导时间，IPTG浓度，摇床转速等等，所以设定在低IPTG浓度下（0.1 mmol/L），在不同温度，诱导时间下的表达对照：1）37 250rpm 5h2）30 180rpm 10h3）23 90rpm 30h过程：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37，250rpm培养过 夜。将过夜培养菌液以1:100转接于含上述抗生素的50mL+50mL+60mL液体LB中，37，250rpm，3.5h（大量培养至 OD600＝0.6左右）。从60mL培养液中取10mL作为未诱导对照，标记3个50mL LB培养菌液：1、37 250rpm 5h 2、30 180rpm 10h 3、23 90rpm 30h都分5次取样：37 每一小时取样一次（取10mL）编号为：371、372、373、374、37530 每二小时取样一次（取10mL）编号为：301、302、303、304、30537 每五小时取样一次（取10mL）编号为：231、232、233、234、235诱导培养结束后，将上述样品分别破菌离心，得上清与沉淀，加2× 上样缓冲液，沸水浴10min，SDS检测。SDS检测：1、37 M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀2、30 M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀3、23 M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀4、以不同温度下的最优可溶表达做比较结果如下：图3：37条件下五个样的上清和沉淀1: 371上清，2: 371沉淀，3: 372上清，4: 372沉淀，5: 373上清，6: 373沉淀，7: 374上清，8: 374沉淀，9: 375上清，10: 375沉淀 图4图4：30条件下五个样的上清和沉淀1: 301上清，2: 301沉淀，3: 302上清，4: 302沉淀，5: 303上清，6: 303沉淀，7: 304上清，8: 304沉淀，9: 305上清，10: 305沉淀图5：23条件下五个样的上清和沉淀1: 231上清，2: 231沉淀，3: 232上清，4: 232沉淀，5: 233上清，6: 233沉淀，7: 234上清，8: 234沉淀，9: 235上清，10: 235沉淀图6:不同温度下的最优可溶表达1: 234上清，2: