RNA干扰对血管内皮生长因子在人宫颈癌细胞系Hela细胞中表达及细胞增殖影响.pdfVIP

RNA 干扰对血管内皮生长因子在人宫颈癌细胞系 Hela 细胞中表达及细胞增殖的影响 1 1 2 1 刘素梅 ，赵淑萍 ，王泽华 ，戴淑真 1 青岛大学医学院附属医院妇产科，山东青岛（266003 ） 2 华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，湖北武汉（430022 ） E-mail ：zhaoshuping2006@163.com 摘 要：目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ， VEGF) 的小分子 干扰RNA （siRNA ）对培养的人宫颈癌Hela 细胞增殖的影响，检测VEGF 基因及其蛋白表 达的情况，了解VEGF 基因在宫颈癌发生、发展中的作用。方法 根据 siRNA 序列设计原 则，设计并合成针对VEGF165 序列特异性小干扰RNA （siRNA ）及阴性对照siRNA，转染 人宫颈癌Hela 细胞。筛选出最有效的siRNA 干扰序列后，用实时荧光定量RT-PCR 方法检 测转染后Hela 细胞中VEGF mRNA 的表达，VEGF mRNA 的表达以PCR 循环数阈值（Ct 值）表示，12h 开始观察和检测所产生RNA 干扰的效果。Western Blot 方法检测VEGF-165 蛋白的表达，MTT 及细胞计数法检测siRNA 转染对培养细胞生长增殖的影响。结果 VEGF siRNA 转染Hela 细胞后，与对照组相比VEGF mRNA 表达水平明显下降，VEGF 蛋白表达 明显减弱，差异有统计学意义(P0.05) 。实验组 Hela 细胞生长较对照组明显受到抑制 (P0.05) ，从形态学的角度，实验组的细胞明显变小、皱缩、变圆并开始脱落，而无关序列 siRNA 及对照则无明显改变（P0.05 ），随着时间延长，效果越明显，72 h 干扰效率最高。 本实验重复性强，同样的实验重复三次结果一致。结论 VEGFsiRNA 可以有效抑制宫颈癌 Hela 细胞VEGF mRNA 及其蛋白的表达水平，抑制细胞生长，表明VEGF 基因在宫颈癌的 发生、发展中具有重要作用。 关键词：RNA ，小分子干扰 ；内皮生长因子；荧光定量 RT-PCR；基因，抑制，肿瘤；宫 颈肿瘤 肿瘤的生长和转移与肿瘤血管的生成有着密切的关系，肿瘤细胞可分泌血管内皮细胞生 长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF) 等促血管生长因子，VEGF是体内一种强效 力的促血管生成因子，能直接或间接参与血管生成，以促进肿瘤血管新生的方式促进肿瘤的 生长，而且还以自分泌的形式促进肿瘤细胞自身生长，因此，VEGF在恶性肿瘤的发生、发 展及预后中具有极其重要的地位[1]，是目前阻断血管形成探索抑制肿瘤的新途径之一。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是新近发现的一种重要的转录后基因沉默现象，是 指内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)导入细胞时， 该序列mRNA发生特异性的降解，并导致基因表达的沉默[2] 。近年来这一技术发展迅速，目 前已成为基因功能研究的强大工具，并在疾病如艾滋病、白血病和肿瘤的基因治疗中取得了 ， ， 巨大进展[3 4 5] 。本研究选用高表达VEGF基因的宫颈癌细胞系Hela细胞，利用RNAi技术， 转染Hela细胞，观察Hela细胞中VEGF基因表达的变化，为进一步探索以VEGF作为靶点的肿 瘤基因治疗提供理论依据。 1. 材料与方法 1.1 主要材料和试剂 人宫颈癌细胞系 Hela 细胞由本实验室保存。引物和探针序列由上海生物工程技术服务有限 公司合成（序列见表 1）,siRNA 由武汉晶赛生物技术公司合成（序列见表2 ）,RNA 提取试 剂盒 Trizol Reagant 为 GIBCO 公司产品, RNAiFectTM Transfection 试剂盒购于 Qiagen 公司, TAKARA ExScriptTM