CaMKII对于心脏钠离子电流影响.docVIP

在豚鼠心肌细胞中通过Ca/CaM和Ca/CaMKII途径的Na通道调节 目标：钙调蛋白通过与C末端IQ样模体结合调节Na通道的门闸。钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2（CaMKII）调节钙离子的代谢。而且，慢性的CaMKII的高表达和左心室肥大、左心室功能障碍和致命性的心律失常联系密切。然而，Ca/CaM和CaMKII在对于Na通道的急性作用尚未被阐明。 方法和目的：提纯Nav1.5——谷胱甘肽——S——转移酶融合多肽在试管中被CaMKII在第1和第2个链接点上明显的磷酸化。在吸管液溶液中用细胞电压钳来测量分离的豚鼠心室肌在CaM或CaMKII缺失或存在的条件下Na离子的流量。CaMKII改变了电压依赖性钠离子通道的阈值约5mv,加快了从不应期的恢复时间，减少了进入中间状态或慢性失活的时间，和增加了持久（晚期）电流，但没有改变钠电流的延迟。这些由CaMKII诱导的钠离子通道闸门的改变效应可以被特殊的CaMKII阻断剂完全消除，autocamtide-2相关抑制肽（AIP）。Ca/CaM可以单独复制CaMKII诱导的钠离子通道阈值的改变和部分通道经历慢性失活期，但是没有改变从失活期的恢复时间或者晚期电流主体部分。更进一步，CaM诱导的改变也能被AIP完全的抑制。另一个方面，cAMP依赖的蛋白激酶A抑制剂没有消除CaM/CaMKII诱导的钠离子通道功能改变的效应。 结论：Ca/CaM和CaMKII在心脏钠离子通道的失活期的表型有显著的影响。CaM单独作用和CaMKII在心脏钠离子通道门闸上的作用之间的差异是一致的。 关键词：钠离子通道；钙；钙调素；CaMKII 1.引文：电压依赖型的钠离子通道是一种跨膜蛋白，它的效应对应于动作电位的升支，而动作电位又是细胞兴奋的标志并决定了冲动传导的速率。在人类，异常的钠离子通道闸门是一些心脏疾病的基础，如长QT综合征（LQT3），Brugada综合征，和遗传性心脏传导疾病，它可以导致致命性的室性心律失常。钠离子通道闸门的异常也可以发现在后天性的疾病中，如心脏缺血和心力衰竭，异常的钠离子通道调节可能引起室性心律失常和心源性猝死。 许多调节钠离子通道功能的信号传导通路在心脏疾病时发生改变，如cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)和PKC、钙离子等，它们在心肌兴奋——收缩偶联中扮演了一个基础性的角色；然而，在细胞内钙离子靠什么直接调节钠离子通道的功能，这其中的机制还没有被完全阐明。CaM通过与C-末端的IQ样模体的结合来调节钠离子的门控通道。在许多类型的细胞中，CaMKII是最终重要的Ca信号的换能器之一，而且在多种生物中是高度保守的。CaMKII在心脏生理中扮演了一个重要的角色，而CaMKII在心肌中的特异性作用却很难被明确，因为它的效应靶点集中在PKA的作用靶点上，而PKA是心脏对儿茶酚胺反应的主要的媒介。CaMKII调节钙离子的代谢，CaMKII的高表达可引起左心室肥大和功能障碍、致死性心律失常。CaMKII对心脏钠离子电流的影响是通过腺病毒转染的CaMKII的高表达来测量的。然而，Ca/CaM和CaMKII或PKA对于心脏钠离子通道的直接生理功能尚存在争论。本实验的目的是探究Ca/CaM和CaMKII或PKA对于心脏钠离子通道的直接影响。我们阐明了CaM和CaMKII在心脏钠离子通道的失活期表型有明显的影响，这种影响和CaM单独介导的CaMKII对心脏钠离子通道门闸的影响是一致的。这些发现只是呈现出了这种作用的初步形式。 2.方法：这项研究得到了“实验动物使用和监管指导委员会”的批准，并由在美国国家健康协会发表，而且得到约翰，霍普金医学会的动物监管和使用委员会的批准。 2.1分离的豚鼠左心室肌细胞 单独的心室肌细胞来自于成年的豚鼠心脏，用以前使用的酶溶液消化法获得。经酶消化后，细胞被保存在室温条件下的高钾溶液中（mm:谷氨酸钾120，KCL25，MgCl2 1,葡萄糖10，羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）10,乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ EGTA） 1，pH7.4）直到使用。 2.2膜片钳实验 整式细胞电压钳配合Axopatch 200A型电生理膜片钳放大器（分子设备公司）用来在室温22度测量钠离子的电流。电压要求程序由定制的软件产生。电容补偿最佳化和连续电阻补偿40-80%。膜电流经5kHZ滤过和通过digidata-1200 数/模转换器界面采用12 bit分辨率数字化（分子设备公司）。在移管液（包含 mm:NaCl 5,CsCl 40,谷氨酸 80,CsOH 80,Mg-ATP 5,EGTA 5,HEPES 10,和CaCl2 1.5,(自由钙离子=10nM,pH=7.2,CsOH,液体接界电位=+5mv)）浸没的条件下，吸膜电阻有1-1.5MΩ。基本溶液包含（mm）：NaCl 10,MgCl2