中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶 2 基因的分子特性和 生物学功能.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(7): 1321-1329 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.009 中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2 基因的分子特性和 生物学功能 于荣荣，丁国伟，郭亚平，马恩波，张建珍 （山西大学应用生物学研究所，太原030006 ） 摘要： 【目的】研究中华稻蝗（Oxya chinensis ）几丁质脱乙酰基酶（chitin deacetylase，CDA ）基因的 分子特性和生物学功能，为新型农药靶标筛选提供科学依据。【方法】采用生物信息学方法在稻蝗转录组数据库中 搜索获得几丁质脱乙酰基酶基因cDNA 序列，对其进行保守区域分析，选取赤拟谷盗（Tribolium castaneum ）、果 蝇（Drosophila melanogaster ）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae ）、家蚕（Bombyx mori ）和云杉卷叶蛾 （Choristoneura fumiferana ）等昆虫物种的同源序列与中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列进行聚类分析， 进一步构建系统发育树；运用real-time PCR 方法检测几丁质脱乙酰基酶基因在中华稻蝗 5 龄若虫不同组织部位 和不同发育天数表皮中的表达特性；进一步采用 RNA 干扰（RNAi ）技术研究该基因对中华稻蝗蜕皮发育的影响。 【结果】在中华稻蝗转录组数据库中搜索获得2 条几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA 全长序列，生物学软件分析其氨 基酸，发现2 条序列均具有信号肽，开放阅读框包含3 个几丁质脱乙酰基酶保守区域：几丁质结合区（ChBD ）、低 密度脂蛋白受体区（LDLa ）和几丁质脱乙酰基催化结合域（CDA ）。聚类分析表明2 条序列分别与所选用的5 种昆 虫CDA2 聚为一支。剪切子聚类分析发现2 条序列分别与5 种昆虫CDA2a 和CDA2b 相聚为一支，综合序列分析和聚 类结果，认为所获得的序列属于几丁质脱乙酰基酶2 基因的 2 个不同剪切子，分别命名为OcCDA2a 和OcCDA2b。 定量PCR 分析表明OcCDA2a 和OcCDA2b 均在中华稻蝗表皮、前肠和后肠中高表达；在5 龄第1 天的表皮中表达量 较高，之后逐步下降，蜕皮前又略有上升；RNAi 研究发现 5 龄第 2 天的若虫注射dsOcCDA2a 或 dsOcCDA2b 24 h 后，与注射dsGFP 的对照相比，目的基因表达量显著降低，沉默效率分别为96.72%和80.43%；进一步观察试虫的 表型，与对照组相比，注射dsOcCDA2 和dsOcCDA2a 的大多数虫体出现龄期延长，脊线开裂，旧表皮不能顺利剥离 而导致虫体扭曲，最终死亡。少数若虫在蜕皮前死亡，未出现异常表型，部分若虫虽蜕至成虫，但四肢无力，行 动缓慢。死亡率分别达到87.5%和94.4%；注射dsOcCDA2b 的试虫无可见表型，可正常蜕皮发育至成虫。 【结论】 中华稻蝗几丁质脱乙酰基酶2 基因具有2 个剪切子，分别为OcCDA2a 和OcCDA2b。OcCDA2a 参与虫体蜕皮，对其生 长发育起着重要的作用，该基因的沉默导致中华稻蝗因蜕皮困难而死亡，而 OcCDA2b 对中华稻蝗的生长发育没有 影响。 关键词：中华稻蝗；几丁质脱乙酰基酶；mRNA 表达；RNA 干扰；表型 Molecular Characterization and Functional Analysis of Chitin Deacetylase 2 Gene in Oxya chinensis YU Rong-rong, DING Guo-wei, GUO Ya-ping, MA En-bo, ZHANG Jian-zhen (Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, Taiyuan 030006) Abstract : 【Objective