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葡萄柚提取物漱口液对变异链球菌和伴放线 放线杆菌抑制作用的研究 研究生： 刘建党 导 师： 黄晓晶 副教授 中文摘要 龋病和牙周病均是由牙菌斑引起的感染性疾病。变异链球菌（Streptococcus mutans ，S.mutans ，简称变链菌）和伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetem- comitans ，Aa)是口腔菌斑的重要组成菌，以菌斑生物膜的形式存在于口腔。变链 菌是主要致龋菌，与龋病的发生有密切关系，而Aa 与局限型侵袭性牙周炎密切相 关，和慢性牙周炎也有一定的关系。葡萄柚提取物（grapefruit-seed extract ，GSE ） 是一种纯天然植物提取物，其内含有大量具有抗氧化能力的多酚类物质，近年研 究发现其具有良好的抗细菌、真菌、病毒和寄生虫作用，同时具有很好的生物相 容性。GSE 漱口液全部采用可食用级原料，不含乙醇、氯、碘、四环素、甲硝唑 等成份，对口腔黏膜无刺激，也不会造成牙表面、黏膜表面染色，更不会引发诸 如：味蕾的味觉降低、抑制唾液的分泌、口干、灼痛、皮疹等不良反应。课题组 前期研究发现GSE 漱口液具有良好的菌斑抑制能力，但其具体作用机制未完全明 了。因此本研究通过GSE 漱口液对变链菌黏附影响和其对变链菌和Aa 的抗菌作 用以及激光共聚焦扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy ，CLSM ）观 察其作用后变链菌生物膜的变化，旨在探讨其用于预防和治疗牙龈炎、牙周炎和 龋病的可行性和机理，为其在临床口腔疾病治疗中的应用提供实验依据。本研究 包括三部分实验： 实验一 葡萄柚提取物溶液对变链菌黏附作用的影响 目的：研究 GSE 溶液对变链菌在光滑玻璃表面黏附的影响。方法：将 GSE 5 漱口液用二倍稀释法稀释成不同浓度的 GSE 溶液（1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、 1/64、1/128、1/256 漱口液原液浓度），通过测定光密度值研究黏附细菌量的变化， 反映其对变链菌在光滑玻璃表面黏附作用的影响；扫描电镜观察变链菌在玻片上 的形态特征。结果：变链菌对光滑玻璃的黏附随GSE 溶液浓度的升高而下降；扫 描电镜显示实验组细菌间基质少，菌细胞清晰，空白组细菌则包裹有较多的不定 形物质。结论：一定浓度的GSE 溶液（≥1/128 漱口液原液浓度）具有抑制变链菌 在光滑玻璃表面黏附的作用。 实验二 葡萄柚提取物溶液对变链菌和伴放线放线杆菌抗菌作用的研究 目的：研究GSE 溶液对Aa 和变链菌的抗菌活性，初步探讨其抗菌机制。方 法：采用液体稀释法测定 GSE 溶液（1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、 1/256、1/512、1/1024 漱口液原液浓度）对Aa 和变链菌的最小抑制浓度和最小杀 菌浓度；同时扫描电镜下观察GSE 溶液（1/16 漱口液原液浓度）对变链菌细胞壁 的影响。 结果：GSE 溶液对Aa 的MIC 为 1/64 漱口液原液浓度，MBC 为 1/32 漱口液原液浓度；对变链菌的MIC 为1/32 漱口液原液浓度，MBC 为1/16 漱口液 原液浓度，扫描电镜观察显示，MBC 浓度GSE （相当于漱口液原液浓度的1/16） 溶液处理后的变链菌出现细胞壁破裂，内容物溢出。结论：GSE 溶液对体外培养 的Aa 和变链菌有明显的抑制和杀灭作用，其抑制机制可能与其中的GSE 破坏细 胞壁结构的完整性有关。 实验三 激光共聚焦扫描显微镜观察葡萄柚提取物漱口液抗变链菌生物膜效果 目的：观察GSE 漱口液对不同阶段变链菌生物膜的作用效果，并与西吡氯铵 漱口液相比较。方法：体外形成 3h、24h 、48h 变链菌生物膜模型，用 GSE 漱口 液分别作用1min 后，荧光染料染色生物膜中的死菌和活菌，CLSM 观察并比较漱 口液处理前后活菌百分比的变化。结果：GSE 漱口液可降低3h 变链菌生物膜外层 和中间层的活菌百分比，以及24h 、48h 生物膜外层的活菌百分比；葡萄柚与西吡 氯铵两种漱口液处理各时段生物膜后，二者之间各层活菌