实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用研究进展.docVIP

实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展 摘要：实时荧光定量ｐｃｒ技术是在ｐｃｒ反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个ｐｃｒ反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。近年来，实时荧光定量ｐｃｒ技术在植物检疫研究上不断深入，大大提高了植物疫情的检测效率和监测防治水平。综合论述了实时荧光定量ｐｃｒ技术在由真菌、细菌、病毒和线虫引发的植物疫情的检测与应用。 关键词：实时荧光定量ｐｃｒ技术；植物检疫；植物病害 ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ fluorescent ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｃｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｈｕａｎｇ ｈａｉ－ｑｕａｎ （ｂｅｉｌｕｎ ｅｎｔｒｙ－ｅｘｉｔ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｂｕｒｅａｕ，ｎｉｎｇｂｏ ３１５８００，ｚｈｅｊｉａｎｇ，ｃｈｉｎａ） ａｂｓｔｒａｃｔ： ｆｑ－ｐｃｒ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａｄｄｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ ｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｃｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ， ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ｐｃｒ） ｐｒｏｃｅｓｓ could be monitored ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ quantitatively ａｎａｌｙｚｅ ｕｎｋｎｏｗｎ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｍａｋｉｎｇ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ． ｆｑ－ｐｃｒ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ， ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ， ａｎｄ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｔｃ． ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ， application of ｆｑ－ｐｃｒ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ was studied ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ detecting ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｐｉｄｅｍｉｃ． tｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｆｕｎｇｉ， ｂａｃｔｅｒｉａ， ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ was comprehensively described． ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｃｒ； ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ； ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ 实时荧光定量ｐｃｒ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｃｒ，ｆｑ－ｐｃｒ）技术是２０世纪９０年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。最早是由ｈｉｇｕｃｈｉ等［１］于１９９２年提出来的，１９９６年由美国ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司推出。与普通ｐｃｒ相比，它具有快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、定量准确等特点。过去实时荧光定量ｐｃｒ技术主要应用在医学诊断、新型农业、基础研究等领域［２］，而在植物检疫中的应用相对较少［３］，随着分子生物学的不断发展，特别是在检疫检验系统，实时荧光定量ｐｃｒ技术已经被广泛用来检测植物病害，有效地遏制了国外有害生物的入侵，保证了生物入境安全。 １ 实时荧光定量ｐｃｒ技术原理 实时荧光定量ｐｃｒ技术是指在ｐｃｒ反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个ｐｃｒ技术进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量ｐｃｒ技术中有一个很重要的概念，即ｃｔ值。ｃ代表循环（ｃｙｃｌｅ），ｔ代表阈值（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）。ｃｔ值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的ｃｔ值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，ｃｔ值越小。因此，要利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，再利用分析软件获得未知样品的ｃｔ值，便能根据标准曲线计算出该样品的起始拷贝数［４］。 ２ 实时荧光定量ｐｃｒ技术检测方法 该检测方法主要分为两大类：第一类是使用特异的双链ｄｎａ（ｄｓｄｎａ）结合染料，常用的有ｓｙｂｒ ｇｒｅｅｎ和ｌｃ ｇｒｅｅｎ；第二类则是应用荧光标记探针，如ｔａｑｍａｎ探针、分子信标等，