表达β-半乳糖苷酶galB16肿瘤模型建立及在抗肿瘤免疫研究中初步应用.pdf

浙江人学硕士。≯术论文 摘要 本论文的主要工作是建立一个以B半乳糖苷酶为标志性抗原的小鼠黑色素 瘤模型一galBl6肿瘤模型。并且在模型成功建立后，运用B一半乳糖苷酶表达载 体作为DNA疫苗，在galBl6肿瘤模型上进行了初步的抗肿瘤免疫方法的研究。 研究工作可以分为几个部分：构建携带0一半乳糖苷酶编码基因的真核表达载体 p39al；p39al载体稳定转染B16小鼠黑色素瘤细胞，获得稳定表达0一半乳糖苷 酶的galBl6细胞；建立表达B一半乳糖苷酶的小鼠galBl6肿瘤模型；用免疫方 法抑制galBl6肿瘤生长的动物实验。 control B—Galactosidasevector上切下完整的B一半乳糖苷酶编码基因，插入到真 体p39al。经过酶切和测序鉴定后，按照Qiagen质粒纯化试剂盒提供的方法抽提 时后X-Gal细胞染色结果显示有细胞呈蓝色，即表达B一半乳糖苷酶。从功能上 验证了构建的p39al载体含有能够在真核细胞中表达的B一半乳糖苷酶编码基 因。 进一步用纯化的p39al表达载体稳定转染B16细胞。通过G418压力筛选来 得到稳定转染了外源基因的单细胞克隆。然后对得到的各个单细胞克隆进行x— Gal细胞染色鉴定，表达B一半乳糖苷酶的细胞将呈蓝色，很容易在光学显微镜 下区别出来。通过这种方法，我们获得了能够表达B一半乳糖苷酶的galBl6细胞 株。 表达B～半乳糖苷酶的galBl6细胞株继续在G418压力下培养，到足够的细 胞量后接种到C57小鼠背部皮下，成功地建立了肿瘤模型。取肿瘤抽提基因组 DNA用B一半乳糖苷酶基因引物从基因水平上进行PCR扩增鉴定，鉴定结果表明所 u 建立的肿瘤基因组中含有B一半乳糖苷酶编码基因片断。然后取肿瘤组织做10 m冰冻切片，对切片进行X—Gal组织染色鉴定，结果肿瘤组织切片可以染成蓝 色。从功能水平上证明所建立的肿瘤模型表达13一半乳糖苷酶。至此，以13一半乳 糖二烀酶为肿瘤标志性抗原的小鼠黑色素瘤模型一galBl6肿瘤模型成功地建立 浙江人。学硕L学术论文 丁。 成功建立表达B一半乳糖苷酶的小鼠galBl6肿瘤模型后，后续丁作就是在该 模型上，针对B一半乳糖苷酶设计免疫疫苗的抗肿瘤免疫方法的研究。在本论文 中，我们也设计了一组动物实验初步观察了以13一半乳糖苷酶表达载体作为DNA 疫苗进行抗肿瘤免疫的效果。实验分为四组，分别采用以下方案免疫小鼠：1) 1826(20u 注射免疫佐剂CpG g／d,鼠)；4)同时注射DNA疫苗和免疫佐剂。实验 结果显示0一半乳糖苷酶表达载体作为DNA疫苗可以抑制galBl6肿瘤的生长， 1826能够增强DNA疫苗的作用。这一结果表明，我们可以把D一 免疫佐剂CpG 半乳糖苷酶当作galBl6肿瘤的内源性抗原，在这一模型上进行针对B一半乳糖苷 酶肿瘤抗原的抗肿瘤免疫的研究，主要是抗肿瘤免疫方法的探索、新型抗肿瘤免 疫佐剂的鉴定等。 关键词：B一半乳糖苷酶小鼠黑色素瘤肿瘤免疫DNA疫苗CpG 2 浙江大学硕十学术论文 Abstract In in theresearchdescribedthis mousemelanomamodel dissertation，a wasestablished．Thenananimal was 13一gatactosidase experiment expressing totestth