白介素-3在家蚕细胞和家蚕幼虫中表达.pdfVIP

摘 要 5kD，郜 蛋白质水平都极其相似的一种lL．3。GIL．3与hlL．3分子量都约为1 有两个糖基化位点。 杆状病毒表达系统是80年代发展起来的超i岛效真核表达系统，。家蚕丰『：佚 病毒表达系统比普通杆状病毒表达系统又具有其多种特有的优势。 鉴定，证明GIL·3基因已经正确插入转移载体多克隆位点。 (家蚕线性化杆状病毒Bm．BacPAK以低MOI感染在家盈Bran细㈣}， 扩增，收集感染72小时上清用超速离心沉淀病毒粒子的方浊抽提痫，霉DNA． 用Aoc I酶切线性化后，与柱层析纯化的重组转移载体质粒DNA共墁染家盘 BmN细胞。待细胞发病后进行两轮空斑筛选纯化，获得啦免隆tE组痫，鞋 1包泳的仃 鉴定证明GIL．3基因已经进入载体病毒，再用表达产物SDS．PAGE 法证明BmBac．G1L3已经不表达作为筛选标记的B一半乳糖箭晦， 后收集感染上清样品，再用2mlPBS悬浮BmN细胞，反复冻融_爿：经超』H波处 理后高速离心取上清，即得细胞内样品。由于长饽猿的细胞株jl抗f隹小埸捩 hlL．3抗 得0本论文采用人红白血病TF．1细胞株进行GIL一3活性测j￡．来日j brnl，细I 的可行性论证。f经TF．1细胞株体外测活，上清样品活性为2．3X101 cm2)细胞细胞内达；【『性 胞内样品活性为2．7X105U／ml，即每瓶(底面积25 为5．4 ELISA 细胞的总活性达1．7X10“U，也即每106细胞的总表达量为3．4Xl()‘u 。 中的GIL．3不能为本论文采用的hIL．3抗体识别，产生假阴{qi结粜。， 本论文研究了5MOI感染BmN单层培养细胞的表达活住曲线。％‘柱#、11『J 感染48h即接近达到表达的最高活性，72小时活性即丌娟f-降。提1：表J点 lI 法初步研究了不同MOI对表达量和表达活性的影响。结果表明细咆内IMOI 感染即可获得与5MOI感染相似的表达量，当MOI小于l时，表达量与活性 一 都急剧下降；在上清中，从o．1MOI到5MOI，表达活性呈对数增加。} 将BmBac．GIL3针刺接种五龄家蚕幼虫，每天收集血淋巴。测活结果表明， 感染第六天的发病的家蚕幼虫混浊血淋巴中具有最高的活性。(即2．32 还表明，家蚕幼虫表达的GIL．3至少有两种表观分子量形式，较小的约18kD， 较大的约23ld)。}一、 关键词：长臂猿白介素．妾 家蚕杆状病毒表达系统i表达 m 致 谢 本论文是在张耀洲教授悉心指导下完成的。张耀洲教授极具丌拓性的思 维、果断的工作作风和严谨的治学态度将使我终生受益。在此论文完成之际， 首先谨向我的导师张耀洲教授表示深深的谢意．此外，特别感谢金勇丰副教 授在整个研究工作中的指导和帮助。 本论文全部工作均在浙江大学生物化学研究所(华家池校区)完成。感谢 生化所所有关心支持我的工作的老师和同学．感谢镇江蚕业研究所副所长郭 锡杰老师在实验多个方面提供的建议和指导；感谢童富淡老师在蛋白质电泳 及照片拍摄方面提供的帮助和指导；感谢邵爱萍老师多方面的支持和帮助： 感谢毛黎娟女士、毛春明先生在细胞培养方面提供的方便；感谢大师兄李青 兵先生的