减毒鼠伤寒沙门菌体内定位分析.pdfVIP

维普资讯 微生物学报 ActaMicrobioligicaSinica 48(1)：80-84；4January2008 ISSN0001·6·209；CN11-·1995／Q http：／／joumals．im．ac．cn 减毒鼠伤寒沙门菌体内定位分析 张辉 ，胡茂志 ，顾志强 ，焦新安 ，耿士忠 ，张晓明，潘志明 (扬州大学，江苏省人兽共患病学重点实验室，测试 中心，扬州 225009) 摘要：分析减毒 鼠伤寒沙门菌口服感染后在小 鼠体 内定位的情况。将构建的红色荧光蛋 白(RFP) 原 核 质粒 pYA33一DsRed，以 电穿孔 法转 化 减 毒 鼠伤 寒沙 门菌 X4550，重 组 菌命 名 为 X4550(33一DsRed)。重组菌分别感染巨噬细胞 RAW264．7和骨髓源树突状细胞 (BMDC)，并用流式 细胞术检测红色荧光细胞荧光强度。此外，以不同剂量重组菌 口服免疫 BALB／c小鼠，并于免疫后 1d、2d、3d、5d、7d取小 鼠脾、肝 、肠系膜淋巴结(MLN)、派伊尔氏结(PP)、腹股沟淋巴结(ILN) 细胞，检测各组织器官中的红色荧光 阳性细胞百分率。重组菌对 RAW264．7细胞和BMDC均具有 良好的侵袭力。口服小鼠后，第 1d，仅在MLN及 PP中检测到RFP阳性细胞，其中PP中阳性细 胞达到 1．4％；第 2d，在 ILN中达到 0．4％；第 3d，各个组织器官中RFP阳性细胞均有上升趋势， 此时在脾、肝中也检测到RFP阳性细胞。第 5d，RFP阳性细胞均减少，第 7d则未检测到任何RFP 阳性细胞。减毒 鼠伤寒沙门菌具有良好的侵袭力，其黏膜移行方式以及对免疫组织器官靶向定位 性，在优化黏膜疫苗 以及提高疫苗免疫效力等方面都具有重要作用。 关键词：减毒鼠伤寒沙门菌；红色荧光蛋 白；定位；黏膜免疫 中图分类号： Q93．$852 文献标识码：A 文章编号：0001—6209(2008)01—0080—05 减毒细菌作为疫苗运送载体的研究已有一定的 1 材料和方法 历史，其 中减毒沙 门菌在运送异源抗原的活疫苗载 体研究中应用较为广泛。减毒沙门菌作为载体的研 1．1 材料 究源于伤寒疫苗 Ty21a，该疫苗株是用于预防人类 1．1．1 菌株和质粒：原核质粒 pYA3333(asd)、营 伤寒病的唯一的注册活疫苗 1【】。在此基础上又对其 养缺陷型大肠埃希氏菌 X6212(asd )及‘ 鼠伤寒沙门 它伤寒疫苗 的候选株进行 了进一步的应用，如伤寒 菌X4550(cya一，crp一，asd一， ，M )为华盛顿大学 沙门菌 CVD908一htrA株、Tyr800株 、ZH9株2【】以及 Dr．Curtiss 博 士 惠 赠 5【；小 鼠 巨 噬 细 胞 系 减毒鼠伤寒沙门菌 SL72073【．4】、X4550[4]等。然而，减 RAW264．76【(ATCCTIB71)由法国巴斯德研究所的 毒沙门菌的侵袭性 、定位、到达各免疫器官或组织 Dr．Leclerc惠赠 ：质粒 pDsRed购 自 Invitrogen 的时间、以及一些诱导免疫应答的早期事件等都不 公司。 完全清楚，而这些因素往往都会影响疫苗的免疫效 1．1．2 主要试剂和仪器 ：DMEM 培养基 、DAP 力。因此，本文 以减毒 鼠伤寒沙门菌 X4550为研究 (DL一2，6一Diaminoheptanedioicacid)购 自Sigma公司： 对象，在体外感染实验 中，证实其对巨噬细胞及 RPMI1640购 自GBICO公司。限制性内切酶及 T4 BMDC具有一定的感染效力：并进一步在体内实验 DNA连接酶购 自大连 Takara公司；重组 GM—CSF 中，对其在体 内各组织器官中的移行定位进行了初 购 自Proptech公司。BALB／c小鼠购 自扬州大学比 步