实验四(研究生).pptVIP

RPMI-1640培养液的配制 1.量取约700ml超纯水，倒入1L烧杯。 2.分别称取3g Hepes、2.4g NaHCO3，加入上述烧杯。 3.剪开一包1640干粉培养基倒入上述液体并用超纯水洗包装袋内部二次，洗液全部移入容器内。 4.容器口用原包装封口，室温磁力搅拌溶解，不要加热。 5.定容至1000ml。 6.过滤除菌。 实验四 细胞培养常用液 生物技术学院 陈白虹 2011.11.29 实验目的 1.了解动物细胞培养所需的常用液。 2.掌握细胞培养实验用水的制备。 3.重点掌握RPMI-1640培养液的配制及操作要求。 细胞培养实验用水的制备 根据临床试验标准国际委员会（NCCLS）标准，将水质分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 级和特殊用水。 Ⅰ级水：测试用时要求最小的干扰物和最大的纯度和精度，如原子吸收、痕量元素分析等。 Ⅱ级水：测试用时有可容忍的细菌存在，例如，不用保存的一般试剂的制备等。 Ⅲ级水：一般洗刷用水，制备高纯度纯水用水，配制微生物培养基用水等。 特殊用水：操作过程中要求除去特殊的污染物，例如组织/细胞培养中除去热源，HPLC中除去痕量有机物等。 中国实验室用水国家标准GB6682-2000 水中的污染物 自动双重纯水蒸馏器 制水前先通电、通水，制水过程需实验人员看护以防止停水导致蒸馏水器损坏。 使用380V电源，安全性能差，耗电量大，运行成本高。 一次蒸馏水质难以满足实验要求，二、三次蒸馏，能源浪费极大，制水过程麻烦。 制备超纯水的复合纯化技术 纯水的应用 水质: 电阻率 10 MW.cm TOC 30 ppb 纯水应用特点：对离子纯度有一定要求，但有机杂质的要求并不严格。 滴定 pH缓冲溶液 玻璃容器清洗 UV 光谱分析 植物细胞培养 灭菌锅供水 超纯水供水 超纯水的应用 水质：电阻率 18.2 MW.cm @25℃, TOC 10 ppb，微生 物1cfu/ml。 超纯水应用特点：对离子纯度、有机物、微生物、颗粒均 有严格要求。 精密仪器分析 分子生物学实验 细胞学实验 超纯水的使用习惯： 现取现用 电阻率只反应离子含量，与无机物含量无关 尽量避免纯水系统中有菌膜形成 细胞培养基的定义 人工模拟细胞体内生长环境，维持细胞生存和促进细胞生长增殖的营养物质。 细胞培养基的种类和组成 ⒈天然培养基 是使用最早的培养基，主要取自于动物体液或 从动物组织分离提取，包括动物血浆、胚胎浸出液、 血清、羊水、腹水等。 优点: 营养成分丰富、培养效果良好。 缺点: 成分复杂、个体差异大、来源有限。 ⒉合成培养基 是根据天然培养基的成分，用化学成分和数量完 全了解的物质经过反复实验筛选、组合后形成的培养 基。 常用的合成培养基有MEM、DMEM、199、RPMI-1640 等，其主要成分为：氨基酸、维生素、糖类、无机盐 和添加动物血清。具有成分精确，重复性强，便于控 制和标准化。 ⒊无血清培养基 主要成分有： ⑴生长因子和激素 ⑵结合蛋白 ⑶贴附因子和伸展因子 ⑷有利细胞生长的因子和元素 RPMI-1640培养基的配制 1.溶解培养基：将1包干粉培养基溶于总量2/3的水中，再用少量水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，搅拌3-4小时。 2.补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。 3.调pH值：加水到900ml，然后用5％ NaHCO3调节pH到7.2，加水至终体积1000ml。 4.过滤除菌：采用0.45和0.22μm滤膜各一张，上层为0.45、下层为0.22μm，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面）朝上。过滤后分装于小瓶中（250ml），4℃保存。 注意事项 ●认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、 HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 ●配制时要保证充分溶解。 ●配制培养基最好使用新制备的三蒸水或超纯水。一般在试验前当天或前一天制备为好。调节pH值的酸碱溶液也应该使用这种水配制。 ●制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养基液体的器具都应进行灭菌）。 ●搅拌时容器口应用锡纸封口，配好后应马上过滤 。●培养液过滤后，要先抽取少许放入培养瓶内在37℃温箱内放置72小时，以检测培养液是否有污染。●4℃保存6-9个月(不含谷氨酰胺)或2-3周(含谷氨酰胺、血清或抗生素) 血 清 牛血清的主要作用 ⑴提供生长因子和激素 ⑵提供贴附因子和伸展因子 ⑶提供结