β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS） 组织化学染色检测转基因植物.pptVIP

β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS） 组织化学染色检测转基因植物 实 验 目 的 学习转GUS基因的植物组织化学染色方法，掌握染色的原理。 实 验 原 理 β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）基因是植物转基因中常用的一个报告基因。GUS基因是从大肠杆菌中分离出来的，在GUS基因附近插入启动子区就产生了转录融合基因或翻译融合基因。在稳定转化的植物中，利用一个简单的组织化学检测就可以精确地分析GUS融合基因的时空表达模式。用X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸）作为底物可以精确地进行活体GUS活性的定位。这一反应分两步进行：首先是切割葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。 实验材料和试剂 实验材料：转GUS基因的烟草叶片 试剂： 1．50mmol/l 磷酸钠缓冲液 A液：称NaH2PO4.2H2O 3.12g，定容100 ml 水中。 B液：称 Na2HPO4.12 H2O 7.17g，定容100 ml 水中。 取39 ml A液、61ml B液混匀 2．缓冲液：50mmol/l 磷酸钠缓冲液中含有0.1 mmol/l K3[Fe(CN)6]、0.1 mmol/l K4[Fe(CN)6].3H2O、1mmol/L EDTA 3．X-gluc母液：称取10mg X-gluc，溶于100μl的N，N-二甲基甲酰胺（DMF，C3H7NO），得到80㎎/ ml 的 X-gluc母液，-20℃保存。 4．X-gluc反应液：取6.5μl X-gluc母液于500μl buffer中 5．70% 乙醇 实 验 步 骤 1．将阴性对照材料和转GUS基因或带有可表达的GUS基因的烟草叶片切成小块，浸入盛有100μl染色液的0.5ml的离心管中。 2．抽真空后37℃温育4-16h。 3．叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性材料呈白色。 4．肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。 5．组织可在70%乙醇中保存数日。 * * 用GUS进行这些实验有如下优点：1）大多数植物组织中GUS活性的本底低；2）反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累；3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。当然，也存在一些缺点：1）虽然非致死检测的研究取得了一些进展，但这一检测对于活体组织仍然不太合适；2）由于酶和产物非常稳定，因而不能真实地反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；3）在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象，但是这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾或者二者都加来使这种渗漏减至最少；4）同所有的组织化学方法一样，其检测结果不是定量的。 用于GUS染色的植物材料的制备方法因涉及的特定组织和器官的不同而异。例如拟南芥的根、花和叶片可以不做任何处理直接染色。但是像烟草和马铃薯这些植物的茎和叶在染色前必须切成薄片。有时特别是当操作大的组织样品时真空渗入法会有所帮助。