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HPLC 使用须知 刘扬中 实验室 请继续补充 2009.08.15 请 阅读 使用手册 !! 更换色谱柱、定量环等，同上。 先观察、学习 1-2 个流程； 在有指导时实验1-2个流程； 确认掌握后，再独立操作。 更换色谱柱、定量环等，同上。 逐步学习软件的使用、数据处理、输出。 如有不确定的问题，请及时咨询。 （公司、手册、Agilent网站、他人、经验交流网站 ） 内容包括 样品的准备 流动相的准备 开机前的准备 进样前的准备 实验步骤 注意事项 实验结束 常见问题及处理 一、 样品的准备 溶解样品的溶剂选择 一、 样品的准备 样品溶液除杂质 二、 流动相的准备 流动相选择 二、 流动相的准备 流动相选择 二、 流动相的准备 流动相选择 二、 流动相的准备 流动相处理 二、 流动相的准备 流动相处理 三、开机前的准备 流动相检查 四、进样前的准备 排气 五、实验步骤 六、注意事项 环境清洁 六、注意事项 压力变化 六、注意事项 变化 七、实验结束 清洗色谱柱、定量环 七、实验结束 更换流动相 八、常见问题及处理 长菌 八、常见问题及处理 过滤白头堵塞 九、错误实例 管路长菌 九、错误实例 过滤白头堵塞 九、错误实例 排气不干净 * 与流动相 相溶 有机流动相： 尽量避免NaCl、磷酸缓冲盐， TEAA较好。 如果不确定，可以先实验溶剂与流动相的相溶性。 在固定相上可保留（针对进样体积较大时） 离子交换柱： 不用高盐溶剂 反相柱： 不用纯有机溶剂 适当的pH 值 离心沉淀悬浮物（可能看不见） 10min 12K （注意：离心管会发热) 。 如果有沉淀，将上清液转移到新的离心管中 过滤（针对进样体积较大时） 水溶液：0.22 ?m 滤膜过滤 （1、5、10ml注射器） 使用高纯度试剂（色谱级溶剂、高纯水、盐） 反相柱，如C18柱（易吸附 极性小的物质） 流动相：高极性?低极性 如：A= H2O, B=CH3OH or CH3CN 梯度应用： 90% A 10%B ? 100% B 注意：除非有说明，反相柱不能使用100% 水，否则会损坏固定相 !! 强阴离子SAX交换柱（易阴离子物质） 流动相：低浓度盐?高浓度盐 （NaCl or 磷酸缓冲盐） 如：A= 50mM NaCl, B= 2 M NaCl 梯度应用： 100% A ? 100% B 分离的样品在A、B中均可溶 !!! 例如：沉淀的发生 DNA + TFA Cu2+、Ni2+ + 磷酸缓冲盐 跨膜肽段 + 水 分离效果 （另外讨论） 更换流动相之前，必须事先阅读色谱柱的说明书 !! （每根色谱柱均有独立的说明书） 注意色谱柱对流动相的要求 （pH值、有机溶剂） 可用pH 值 SAX柱： ？ ~ 7.0 C18柱 SB C18柱 C18柱 0.22 ?m 滤膜过滤，除去悬浮颗粒 所有含盐、或含水溶剂，必须膜过滤 !! 100% 色谱纯有机试剂，最好过滤后使用 过夜溶剂，重新过滤后使用 适当的例外 ： 新近过滤的 100% 色谱纯有机试剂 冬天时，水溶液可以使用1~2 天后再过滤 任何溶剂，如果有可见悬浮物、菌丝，不可使用 !! 除气，可提高分离效果（峰型）、延长仪器寿命。 除气不好时，可能使再现性降低，甚至无法分离。 在旧仪器上常见。 脱气机的处理速度非常有限，无法除去大量气体（如气泡） 泵的入口：有机溶剂在上，水相在下（避免盐沉淀） 溶剂体积检查 – 与程序中体积一致。 除去管路内的气泡。 每次取出、放回 玻璃过滤头均需要检查!! 清理废液瓶 -- 除去管路内可能残留的气泡 旋开Purge阀 ，流速从1 ml/min升至到5 ml/min，压力应该 10 bar 如果压力明显大于10 bar，可能是过滤白头堵塞，需要更换、或清洗。 过滤白头通常可以使用3-6个月，如果过快，可能是流动相不清洁。检查过滤过程的错误。 逐个处理每个需要使用的流动相 3 ~ 5 min，5 ml/min 注意：管路中如果看到气泡，不可使用泵排气!!! 必须事先手工排出气泡。 及时清理台面、清除灰尘 熟悉/记录每个反相色谱柱在1 ml/min 100% CH3OH、CH3CN 时的压力，离子交换柱H2O。 如果压力明显过高，检查原因 （任何堵塞） 压力突然降低 – 检查漏液。 C18 反相柱 应保存于有机溶剂中，不含任何 酸、盐！ 洗净残余的酸(TFA)、缓冲盐 （用90% 纯水、10%有机溶剂，5柱体积） 除去水 （用100% 有机溶剂，如