2014年郭琼出访美国工作报告.docVIP

2014年郭丽琼出访美国工作报告 一、日程安排： 7月30日-8月8日：蛹虫草实验材料准备，提取蛹虫草的活性成分类胡萝卜素CmCa。 8月9日-9月4日：设计不同浓度的类胡萝卜素对肿瘤细胞生长的抑制情况。 9月5日准备回国。 二、工作内容： 蛹虫草类胡萝卜素抑制肿瘤生长的研究 蛹虫草[Cordycep militaris(L.Fr)Link]，别名北冬虫夏草。蛹虫草富含蛋白质、氨基酸及多种活性物质，如核苷类化合物、虫草多糖、虫草酸、麦角甾醇等（其活性成分的含量接近或高出冬虫夏草），而且味道鲜美，深受消费者的喜爱。蛹虫草已能人工进行工厂化栽培，年产量为8000吨，年产值15亿元，而且目前以20%的增长速度递增，是一种极其有开发应用前景的食药用菌。 新近的研究结果表明，蛹虫草除了上面提到的活性成分外，还有一种被忽略的含量比较高的活性成分（可达到干重的0.10-0.15%），这个成分是蛹虫草类胡萝卜素，也称北虫草黄素，蛹虫草类胡萝卜素是目前发现的众多的类胡萝卜素中唯一的能溶于水的色素。前人的研究表明了，类胡萝卜素具有抗肿瘤的作用，而蛹虫草的这种类胡萝卜素是否更有抗肿瘤活性呢？本合作课题就是在这种背景下提出并完成了初步的结果。 材料与方法： 1.1 材料 .1 蛹虫草子实体：购于美国中华大超市。 人类胰腺癌细胞PANC-1注：检测波长：450nm 图1 蛹虫草类胡萝卜素高效液相色谱图 1.2.4 细胞培养PANC-1细胞培养于含10% 胎牛血清，50 U/m青霉素和50 U/mL链霉素的DMEM完全培养液中细胞置于37℃，5% CO2培养箱中培养每2至3天以1:3-1:5传代。体外细胞增殖测定 采用细胞增殖检测试剂盒体外测定细胞增殖。具体步骤如下： 1) 用血球计数板对细胞计数。调整细胞密度至1×106 /mL，按每孔2500个细胞接种于96孔细胞培养板。设置空白对照以调零。 2) 在37℃，5% CO2细胞培养箱中培养24 h后，小心弃去孔内培养液。供测样品经0.22 μm滤器过滤除菌后，用完全培养液稀释成包括对照组在内的6个药物浓度梯度，每孔给药100 μL，设置3个平行孔。 3) 继续培养 24 h，48 h或者72 h，并在倒置显微镜下观察。分别于个时间点小心弃去孔内培养液，每孔加入新鲜完全培养液100 μL和15 μL染料，继续培养4 h。 4) 终止培养，每孔加入终止溶液100 μL，室温放置1 h，使结晶物充分溶解。 5) 用酶标仪测定 570 nm 波长处各孔的吸光值（OD 值）。取三个平行孔的平均OD 值，按照以下公式计算细胞增殖抑制率（%），并计算其半数抑制浓度IC50。 细胞增殖抑制率（%）=（OD对照组-OD实验组）/OD对照组×100%体外细胞毒性测定 采用台酚蓝法体外测定药物对细胞的毒性作用。具体步骤如下： 用血球计数板对细胞计数，调整细胞密度至1×106 /mL。吸取1 mL细胞悬液置于15mL离心管中，设立包括对照组在内的6个浓度梯度，在37℃，5% CO2细胞培养箱中培养24 h。 加入等体积 0.4％台盼蓝染液，室温下染色 3 min。然后吸取10 μL悬液沿血球计数板盖玻片边缘缓缓滴入，将血球计数板放于倒置显微镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，分别数出四角的四个大格（每个大格含有 16 个中格）中所有细胞以及浅蓝色细胞的数目。 利用以下公式计算细胞存活率： 存活细胞（%） = (总细胞数-着色细胞数) /总细胞数×100%。数据统计分析 利用软件 SigmaPlot 11.2.0 (Systat Software Inc., USA) 分析所有数据。重复实验的数据结果均以平均值士方差表示. 利用ANOVA 算法进行数据的统计分析，显著水平设为P 0.05。对人类胰腺癌细胞的增殖抑制作用 μg/m分别处理人类胰腺癌细胞PANC-1细胞增殖测定结果显示，CmCa均抑制PANC-1细胞(IC50-24 h = 28.3 μg/ml, IC50-48 h = 24.5 μg/ml, IC50-72 h = 20.0 μg/ml)。 而且随着CmCa浓度的增加其增值抑制越明显。 图对不同胰腺癌细胞增殖的抑制作用对人类胰腺癌细胞的毒性采用与细胞增殖抑制实验相同浓度的对人类胰腺癌细胞的毒性 细胞处理24 h后，台酚蓝法染色结果显示，均未对细胞产生毒性作用（图3）。此研究证明对细胞增殖所产生的抑制并不依赖于其毒性，尚有其他的机理可循。 图3细胞的毒性作用 1 时间（小时） 细胞增殖抑制率（%） 0 5 10 20 40 80