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siRNA的研究进展 siRNA的研究进展 口硕91 辛欣 RNA 干扰( RNA interference, RNAi,也译作RNA 干预或干涉)指一类小分子干扰RNA( small interfering RNA, siRNA ) 可以高效、特异地阻断体内同源基因表达, 促使同源mRNA 降解, 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型 。 siRNA 和RNAi 的研究和应用, 具有极其重要的理论和实际意义, 它将对医学生物学的发展产生深远的影响。Science杂志将这一新发现评为2002 年度世界十大科学成就之首。 siRNA：双链RNA经酶切后形成的很多长约21～25 个核苷酸的特殊双链RNA。这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。siRNA 两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基. 此外,每条单链的3′端均有2～3 个突出的非配对的碱基 Dicer：RNase III酶能将双链RNA加工成21 — 23 个核苷酸的siRNA。这个酶由基因CG4792 编码，随后被命名为Dicer。Dicer 包含：N 端RNA 解旋酶结构域、Piwi -Argonaute- Zwile/ Pinhead (PAZ) 结构域、两个RNaseIII 结构域及C 末端双链RNA 结合结构域(dsRBD) RISC：siRNA结合到核糖核酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC），该复合体依赖ATP释能将siRNA双链解聚成单链而被激活，活化RISC结合的siRNA反义链与mRNA分子上的靶序列结合，引起mRNA降解，导致基因沉默效应。 反义链：能通过碱基互补配对与靶标mRNA特异的结合。 RdRP（RNA-directed RNA polymerase）：以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶。 RNAa：双链RNA激活基因表达 siRNA脱靶效应（off-target effects，OTEs）：siRNA作用过程中存在非特异性，可对靶基因之外的其它基因发挥作用，导致非靶基因沉默。 理论形成 影响因素 1.干扰RNA类型的选择：siRNA shRNA 2.siRNA的递送过程：核糖核酸酶 肾 靶向性 3.细胞内的RNAi路径：内吞体 AGO蛋白 病毒编码的RNAi沉默抑制因子 生理意义 1.生物抗御机制 2.调控细胞分化与胚胎发育 3.维持基因组的稳定 4.RNA水平上的调控机制 科学意义 1.分子生物学在方法学上新的突破 2.很多小分子调控RNA的发现 3.对生命本质的思考 研究范畴 基因功能研究 RNAi 技术能使基因沉默不表达或以极低水平表达,而且操作相对简便、快捷,费用也比传统的基因敲除低廉,因此是一种快速有效的研究基因功能的新方法。与传统的翻译寡核苷酸相比，同等量的siRNA可以强数10倍，在体内更稳定，半衰期长达24小时，将siRNA导入细胞内，一般可以使基因表达的抑制率达到90%。 FDA批准进行临床试验的RNAi药物 Bevasiranib：湿性老年性黄斑变性（AMD） 2004年：FDA批准Bevasiranib进行临床试验。 2006年9月12日：公司公布II期临床试验结果：能够减缓患者眼睛中血管的生长并改善视力：在最低剂量时，这种效果持续了数月；最高剂量时，这种好的效果一直到研究结束还存在。而且，试验中，除了药物注射位置的红肿外，没有观察到其他任何不良反应。 2009年3月6日：终止三期临床研究 问题与展望 siRNA作为药物的障碍主要在：体内干扰素反应、体内的不稳定状态、靶向性和脱靶效应、递药系统、给药方式以及安全性等。 RNAi效果检测 一般通过定量PCR、Nonhem以及Western blotting等方法检测靶标mRNA水平以及靶蛋白的表达水平来筛选沉默效果最佳的siRNA。 * * * * 概况 历史 现状 展望 相关定义 理论形成 作用机制 基因功能研究 医学应用研究 ...... 需要解决的问题 应用前景 ? ? 理论与实践的结合 相关定义 1993年： 将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。 1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA（anti sense RNA）和正义RNA（sense RNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。 1998年，Andrew Fir