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实验一、分离鉴定氨基酸 层析分离技术（或称色层分析技术）是一种物理分离技术，是利用混合物中各组分的物理化学性质（如吸附力、分子大小和形状、分子亲和力、分子极性、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，达到分离的目的。 根据层析方法所依据的理化性质的不同，层析技术可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、排阻层析、亲和层析等。根据固定相支持剂的质地和形状等的不同，层析技术可分为纸层析、薄层层析、薄膜层析、柱层析等。 层析分离技术因其操作简便，不需要很复杂的设备，样品用量可大可小，故既可用于实验室的分离分析，又适用于工业生产中产品的分离制备。它与光学仪器配合，可组成各种自动化分离分析仪器，进一步显示了层析分离技术的优越性。在生化技术领域里，层析技术已成为一项最常用的分离分析方法。此项技术可用于研究物质组成和分离纯化各种成分。通常用于分离分析氨基酸、核苷酸、糖类、激素、维生素等成分。其优点是能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质，设备简单，操作容易，样品用量少，结果较准确。 本实验目的在于掌握层析法的一般原理和操作技术，学会氨基酸的鉴定方法。 一、纸层析 纸层析是分配层析的一种，即以分配系数的不同，使不同物质在不同相中不同程度地分配，从而达到分离的目的。 一种物质在不同的溶剂中具有不同的溶解度。所谓分配系数就是一种溶质在两种存在于同一系统而相互不溶的溶剂中溶解达到动态平衡时，溶质在两相中的浓度比值，通常用表示： 各种物质的分配系数在一定条件下是一个常数。 将两种溶剂中的一相用一种支持剂加以固定，称为固定相。让另一相从这相上流过，称为流动相。这样，分配系数可表示为： 纸层析是以滤纸作支持剂的分配层析。层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。由于滤纸纤维与水有较强的亲和力，能吸附22％左右的水，而与有机溶剂的亲和力很弱，它可以在纸的毛细管中流动。因此，以水作固定相，而以与水不相溶的有机溶剂作流动相。层析时，将滤纸的一端浸入展层剂中，有机溶剂就会连续不断地通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据其本身的分配系数不断地在两相间进行分配。分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并进行重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配的数量就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，向前移动的速度快；而分配系数大的溶质在固定相中分配的数量多，移动的速度慢。所以各种溶质在层析的过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。 溶质迁移的速度用迁移率表示，符号为。 各种化合物在恒定的条件下，经层析后都有其一定的值，即在层析图谱中有一定的位置。 决定值的因素主要是分配系数，而分配系数受以下因素的影响： 值较小，而侧链含非极性基团的氨基酸易分配在有机相中，值较大。 3. 溶剂的纯度、pH值和含水量：pH值和含水量的改变可使氨基酸和展层剂的极性改变，值也随之改变。 值也改变。值小。 （二）实验材料、仪器与试剂 1. 实验材料：绿豆芽。 2. 仪器：吹风机、层析缸、培养皿、毛细管、针线、尺子、曲别针、新华1号滤纸等。 （1） 标准氨基酸溶液：0.1％的赖氨酸（Lys）、天冬氨酸（）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（）、苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（）及上述各种氨基酸溶液等体积的混合液。 2） 展层剂及显色剂：按正丁醇:95％乙醇:冰乙酸:水＝4:1:1:2配成展层剂后，再以其配成0.1％的水合茚三酮试剂。 1. 点样：取新华1号滤纸一张，于距一端2cm处用铅笔画一道直线，并均匀分出1个点，其中8个点分别点8种标准氨基酸（各点4～5次），个点点混合氨基酸（7～8次），个点点样品（7～8次）。 2. 层析：取大小合适的层析缸一个，其底部放上直径为10cm左右的培养皿。1.5cm深的展层剂，盖严，平衡20min。3cm左右时（约4～5h），层析停止，取出滤纸，用铅笔画下前沿线。 4. 分析：用铅笔描绘出色斑轮廓，计算各样点的值，依据值及颜色与标准氨基酸比较，鉴定出各样点的氨基酸名称，并得出绿豆芽中所含游离氨基酸的种类。 薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。 1. 实验材料：绿豆芽。 2. 仪器:薄层涂布器、研钵、试管、烘箱、真空干燥器、微量注射器、玻璃缸、喷雾器等。 （1）薄层板制备：称取