MS2介导的口蹄疫病毒颗粒疫苗的研究.docVIP

MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究 董艳美1，张国广1,2，汪卫1，范红军3，陈亮* 1 厦门大学生命科学学院，福建 厦门 361005;2 漳州师范学院生命科学与技术系，福建 漳州 363000;3 河南师范大学生命科学学院，河南 新乡 453000) 摘 要: 研究表明口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）的VP1蛋白含有关键的抗原决定簇。根据O型HLJOC12/03猪源口蹄疫病毒（FMDV）毒株VP1上第141-160位氨基酸序列设计引物，利用重叠延伸PCR（SOE PCR）技术将该序列插入在大肠杆菌噬菌体MS2外壳蛋白基因的特定位点。然后连接到原核表达载体pET28a上，构建了重组表达质粒28a-CP-VP1，转化BL21（DE3），ITPG诱导表达得到融合表达的CP-VP1。透射电子显微镜下观察融合蛋白CP-VP1成类病毒颗粒（Virus-like particles, VLPs）状。间接ELISA实验证实该蛋白能够特异地结合豚鼠抗O型口蹄疫病毒的阳性血清，30 μg的CP-VP1类病毒颗粒蛋白免疫小鼠后可以诱导其产生了高效价的特异的抗体。故该口蹄疫病毒抗原决定簇展示在噬菌体MS2上表面的类病毒颗粒蛋白具有开发成口蹄疫疫苗的前景。 关键词:口蹄疫；MS2噬菌体；抗原决定簇类病毒颗粒中图分类号 文献标识码Ａ 文章编号 口蹄疫（Foot-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的危害牛、猪、羊、骆驼、鹿、牦牛等约70种家畜及野生偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病[1-5]。因为其一旦爆发则传播速度快,流行范围广，补救措施少，可造成上百亿美元的直接经济损失，故被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物传染病，我国规定其为一类动物疾病 [1, 5]。FMDV为单股正链RNA病毒，主要有7个血清型[6, 7]，近年来，爆发流行于我国境内的大都是O型，A型和Asia I型[5]。自缅甸98（MYA98）谱系口蹄疫病毒2010年2月在我国广州白云区疫区首次发现以来，该病毒已经持续地给我国多省的畜牧业造成了巨大的损失，并且该病毒在不同宿主变异较大。虽然传统的灭活苗的免疫原性比较好，也在口蹄疫疫情的控制和在动物保护上发挥了极其重要的作用 但是，灭活苗在生产过程中不仅要求严格，且存在安全隐患的问题[8, 9]；并且免疫动物和感染 收稿日期：2012-11-07 基金项目：厦门市科技计划项目(NO. 3502，福建省科技厅重点项目(NO. 2009N0051)和福建省自然科学基金(NO. 2010J01240?)资助 作者简介：董艳美 (1981- )，女，博士研究生．diy1129@163.com.研究方向：口蹄疫疫苗 通讯作者：陈亮，男，教授，博导，E-mail：chenlg@ FMDV的动物无法很好区分，限制了动物产品的出口；此外，灭活苗的有效期较短，诸如此类的缺陷使得寻找更安全稳定的新型疫苗成了科学工作者的大方向[3, 10-12]。与传统疫苗相比，基因工程疫苗是一类非常安全高效的疫苗。 大肠杆菌MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3 659 bp，编码成熟酶蛋白（或A蛋白）、外壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子[13, 14]。研究发现，体外将MS2 噬菌体的成熟酶蛋白和外壳蛋白的基因以及包含基因调节元件的5′非编码序列的基因克隆到表达载体中，诱导表达后的蛋白可自我组装为成熟的类病毒颗粒[15, 16]，且在其外壳蛋白基因的特定位点处插入几个基因可以表达成外源氨基酸展示的类病毒颗粒状[17, 18]，以此，我们可以开发出类病毒颗粒疫苗。类病毒颗粒疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，其具有强大的免疫优势：表面结构规则，大小合适，易于被免疫系统识别并产生很好的免疫效果；在血清中的半衰期较长等等[19]。本项研究选择了O/ HLJOC12/03毒株口蹄疫病毒VP1蛋白上关键的抗原决定簇第141-160位氨基酸[1, 10, 20]对应的核苷酸序列，利用SOE PCR插入到MS2 噬菌体的外壳蛋白基因的特定位点，经过大肠杆菌诱导表达出O/ HLJOC 12/03口蹄疫病毒的抗原决定簇多肽表达展示在MS2病毒样颗粒的表面的类病毒颗粒。体外和体内的免疫学实验都证实该类病毒颗粒蛋白可以很好地诱导被免疫的小鼠产生特异的抗体，且具有很好的免疫原性。本项实验研究结果为进一步开发出新型的口蹄疫类病毒颗粒疫苗提供了实验依据。 1 材料