代谢考题答案.docVIP

1. 微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段 定义：代谢工程是利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络, 并通过 DNA 重组技术和应用分析生物学相关的遗传学手段对细胞进行有精确目标的基因操作, 改变微生物原有的代谢或调节系统, 实现目的产物代谢活性的提高； 研究内容：①生物合成相关代谢调控和代谢网络理论； ②代谢流的定量分析； ③代谢网络的重新设计；④中心代谢作用机理及相关代谢分析；⑤基因操作。 研究手段：(1)检测技术：常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究。这包括：体内确定代谢流的物料平衡和同位素标记示踪方法；表征酶促反应进程和性质的酶促反应动力学分析方法;测定同位素富集和关键代谢物相对分子质量分布的光谱学方法(核磁共振、质谱、液相色谱分析和气相色谱分析等)；生物传感器技术。根据些检测信息可以判断和描述代谢流的基本状态，并为细胞的代谢流及其控制分析提供翔实可靠的原始数据。 (2) 分析技术：在获得大量生化反应基本数据的基础上，采用化学计量学、分子反应动力学和化学程学的研究方法并结合先进的计算机技术，可以进一步阐明细胞代谢网络的动态特征与控制机理，以确定代谢改造的思路。这些分析手段包括能准确测定细胞内代谢网络流的稳态法、展示代谢流控制过程的扰动法、简化复杂代等提出的的组合法以及代谢网络优化技术等。 (3) 基因操作技术：在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作。这个过程涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。代谢工程技术得以广泛应用的一个重要前提就是外源基因在所有生物物种（包括人体）中转化和表达的可行性，而这种可行性又在很大程度上依赖于各种载体和基因表达调控元件的开发。 2代谢改造思路和代谢设计原理 代谢改造思路 代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。 (1)改变代谢途径方法 加速限速反应：增加限速酶的表达量，来提高产物产率。然而限速酶反应的改变可能会给整个代谢网络带来负面影响。 改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。 (2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 (3)转移或构建新的代谢途 通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。 代谢设计原理 现存代谢途径中改变增加目的产物代谢流 (1)增加限速酶编码基因的拷贝数：没有改变代谢流，只是增加了酶的量，提高了中间物的浓度，从而提高限速反应的反应速率；(2)强化以启动子为主的关键基因的表达系统可以提高产物的转化率；(3)提高目标途径激活因子的合成速率 ；(4)灭活目标途径抑制因子的编码基因 ；(5)阻断与目标途径相竟争的代谢途径；(6)改变分支代谢途径流向：提高某一分支途径中的酶活力，从而使该分支途径在竟争中处于有利的地位。 (7) 构建代谢旁路：大肠杆菌糖代谢未端产物乙酸能抑制菌体的生长，应用代谢工程的方法将枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中，构建新的代谢旁路，结果能明显的降低细胞中的乙酸浓度，使乙酸始终处于较低的水平。 (8)改变能量代谢途径：如将血红蛋白基因导入大肠杆菌或链霉菌中，不仅在限氧条件下可以提高宿主细胞的生长速率，而且也可以促进蛋白和抗生素的合成。血红蛋白的作用在于在限氧条件下提高了ATP的产生效率。 在现存途径中改变物流的性质：指使手原有途径更换初始底物或中间产物，以达到获得新产物的目的。可以通过以下两种方法： (1) 利用酶对前体库分子结构的宽容性：如利用酶的相对专一性，投入非理想型初始底物参与代谢转化反应，就可以进而合成细胞原不存在的化合物。 (2) 通过修饰酶分子以拓展底物识别范围：修饰酶分子的结构域功能域，以扩大酶分子对底物的识别范围和催化范围。 在现存途径基础了扩展代谢途径：在宿主菌中克隆、表达特定外源基因可以延伸代谢途径，从而生产新的代谢产物、提高产率。 3微生物的基因操作技术有哪些？（举两例说明） 技术： ⑴核酸的凝胶电泳：在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动，其迁移速度与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分