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关于TOPO和GATEWAY 一、TOPO平端克隆 拓扑异构酶简介 –TOPO?克隆载体利用了DNA拓扑异构酶I，加快了PCR克隆 –拓扑异构酶I在位点CCCTT切断并松弛超螺旋DNA，然后重新连接末端。这样，其同时作为限制酶和连接酶。 TOPO克隆原理 TOPO克隆是一种将拓扑异构酶与 T- 载体相结合的 PCR 产物快速克隆系统 pCR-TOPO ，无需 DNA 连接酶做连接。Vaccinia） 病毒拓扑异构酶 可以结合在双链 DNA 的特异位点上，并可在一条链上于 5’-CCCTT 序列之后打开磷酸二酯键（cleave the phosphodiester backbone），释放出的能量可催化 DNA 切口处的 3 磷酸基团与拓扑异构酶 的第 274 位的酪氨酸（Tyr）残基共价结合，同样这个共价键又会受到切口处 5 羟基的攻击，进行可逆反应，恢复切口处磷酸二酯键，重新将 DNA 连接起来。 pCR-TOPO 载体就是根据拓扑异构酶 的这一性质来开发的， pCR-TOPO 载体也是一种 T 载体，只是在其 3末端的突出 T 上共价结合了一个拓扑异构酶 ，当带 3 末端的突出 A 的 PCR 产物与该 T 载体互补配对时，拓扑异构酶 就将该缺口连接起来。pCR-TOPO 载体的工作模式图??? pCR-Blunt 是一种用于提高克隆平末端片段效率的载体，该载体最大特点是在 lacZ‘ 基因的下游融合了一个 ccdB （Control of cell death）基因，该基因对大肠杆菌是致死的。该载体大小为 3.5kb ，含卡那霉素抗性基因和 Zerocin 抗性基因。在克隆外源平末端 DNA 片段时，先将改载体切成线状，再与目标 DNA 连接，转化大肠杆菌。如果载体发生自连，获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡，只有当外源 DNA 片段与载体连接后， ccdB 基因的表达受到阻断，重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来。如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNA gyrase（促旋酶），造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。如果有插入片断，则ccdB基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间。Topo平端克隆与Topo TA方法一样，操作简单快速 （图2） TOPO克隆高效性原理 Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。 （图3） 实验步骤及方法 1、进行扩增，得到目的产物，检测 ，无需纯化 2、进行TOPO克隆 试剂 化学感受态细胞 电子感受态细胞 新鲜PCR产物 盐溶液 稀释盐溶液1：4 水 pCR-Blunt II-TOPO 0.5-4μl 1μl —— 加至5μl 1μl 0.5-4μl —— 1μl 加至5μl 1μl 总体积 6μl 6μl （表1） 1)连接：按上表进行配制溶液后，轻轻混匀，室温静置5min 2）转化：将试管置于冰盒中进行冰浴5-30min 3）然后在42℃热击30S’后立即冰浴 4）在室温下添加250μl S.O.C.培养基 5）37℃ ，200rpm，摇床孵化1h 6）用10-50μl，涂于平板上，正放5min后，37摄氏度倒置培养过夜 7）直接进行PCR检测，或挑取菌落在50μl含有50 μg/ml氨苄或25 μg/ml Zeocin?的LB培养基（置于200μl微量离心管中）培养4h 或者： Fresh PCR product 1.33 μl (from Step 1) Salt Solution 0.33 μl (in kit（试剂盒） in -20°C freezer) TOPO Vector（载体） 0.33 μl (in kit（试剂盒） in -20°C freezer) FINAL VOLUME 2.00 μl 1) 连接：按上表进行配制溶液后，轻轻混匀，室温静置5min 2）转化：将试管置于冰盒中进行冰浴5-30min 3）然后在42℃热击30S’后立即冰浴 4）在室温下添加83μl S.O.C.培养基 5）37℃ ，200rpm，摇床孵化1h 6）用10-50μl，涂于平板上，正放5min后，37摄氏度倒置培养过夜 7）直接进行PCR检测，或挑取菌落在50μl含有50 μg/ml氨苄或25 μg/ml Zeocin?的LB培养基（置于200μl微量离心管中）培养4h 二、Gateway技术 Gateway? 克隆的强大性和灵活性 在目的基因（go或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway? 入门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体，创建各种各种各样的表达克隆。当每一个基因具有进行Gateway? 重组的att序列