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* 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST（或PBST）中漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。这时，可改用其他检测方法或换用丽春红S。 转膜后检测，多用丽春红染色，可见多条粉红色条带。 按照所检测蛋白分子量大小切下膜条，做好标记。 * 4. 封闭(Blocking) 杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。常用的封闭试剂有 5%的 BSA 或者脱脂奶粉，缓冲液一般选择 PBST 或者TBST。 将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TBST稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TBST将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。 一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡1～2h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。 封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST 或者PBST。 * 5. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 5.1 参考一抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释一抗。5.2 吸尽封闭液后，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1～2小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。5.3 回收一抗。然后加入Western洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 6.1 参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。 6.2 吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1～2小时。 6.3 回收二抗。然后加入Western洗涤液，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 前2步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。洗涤液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。 第3步TBS洗涤是为了洗去膜上的Tween20，因为它可以阻碍底物的沉积。 一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；还要注意一抗二抗的匹配。 * 7. 蛋白检测(Detection of proteins) 在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺(luminol，氨基苯二酰一肼)并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。 ① HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存②?AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66micro;lNBT溶液和33micro;l BCIP溶液混匀