利用血细胞计数仪进行细胞计数.docVIP

利用血细胞计数板进行细胞计数： 像数1，2，3 许多关于细胞利用的一些生物学应用，如微生物学、细胞培养、血液检查等要求我们在实验中确定细胞的浓度。 细胞计数非常简单，需要有一个计数板，称为血细胞计数板，或血细胞计数器。19世纪法国解剖学家Louis-Charles Malassez发明了这种血细胞计数板。血细胞计数板是由一片较厚的特制玻片构成，中间有一个垂直线网格。网格的尺寸是给定的，因此每条线覆盖的区域是已知的，这样就可以对一定体积内的溶液中的细胞数量进行计数，为后期的血细胞检测奠定基础。 最为常见的血细胞计数板类型的中部有一个“H”形结构，上面有两个像镜子一样抛光的网格表面，并可在上面加上外罩。 加载血细胞计数板 开始进行计数之前，用擦镜纸拭去灰尘颗粒，确保血细胞计数板及其盖玻片处于洁净状态。安装在血细胞计数板上的盖玻片是特制的，明显厚于传统的显微镜盖玻片， 这是因为它必须能够克服液滴的表面张力。 确保在加载细胞悬液之前，先将盖玻片放置在计数表面，然后将吸液头和样本放进其中的一个V型孔中，并小心地挤出样本。利用毛细管作用充填盖玻片下部的区域。必须放入足够的液体以便覆盖整个镜片的表面，通常需要大约10ul，但不要溢出表面。您可以在一台血细胞计数板中加载两个样本，每个样本进入两个网格。 将加载完的血细胞计数板放置在显微镜台上，然后将计数格在低倍镜焦距中显示。将样本静置几分钟，不要移动盖玻片，以免产生气泡导致计数困难。 在血细胞计数板上进行血细胞计数 一个血细胞计数板的整个网格包括9个方格，每个方格的面积为1mm2。 血细胞计数板的中心区域有25个较大的方格，每个大的方格中又包含16个小方格。当进行计数时，仅对那些位于大方格两侧的各行中的细胞进行计数，以避免重复计数。悬液必须稀释到足够的程度，这样，细胞或其它颗粒才能均匀分布，不会再网格中相互重叠。 为了判断细胞的活性， 通常采用一种特殊的染色剂（如用台盼蓝稀释样本）。这种染色方法，又称为染色排除法，选用一种重氮染料，它可以进入死细胞的细胞膜，将它们染成蓝色；而这种染料不会被活细胞的细胞膜所吸收，由此，活细胞不会被染色。当在显微镜下进行观察时，死细胞呈深蓝色。 为了进行计数，需要确定在所选的方格内识别目标细胞类型并计算系统化细胞计数所需的放大倍数，这样总计数大约为100个，这是统计学显著性计数所需的最低细胞数量。 对于较大的细胞，您只需对角上的四个和中间的一个大方块中的细胞进行计数即可。对于小细胞的浓悬浮液，您可能希望对中间方格的4个外部和中间的方格进行计数，或进一步稀释悬液。 切记！如果存在细胞与边线重叠的情况，若与顶部或右侧边线重叠，其计算在“内”；若与底部或左侧边线重叠，其计算在“外”。 如果中间区域和每个角落的方格为1 mm x 1 mm = 1 mm2:每个方格的深度为 0.1 mm。每个方格在该深度的最终体积为100nl。 一旦您获得了细胞计数的总数，可以通过下列公式计算细胞浓度： 细胞总数/ml＝统计的细胞总数×（稀释因子/方格数）×10，000细胞/ml 因此，如果您用1:1的台盼蓝对样本进行稀释，并在4个角落的方格加上中间大方格中统计得到325个细胞，则每毫升（ml ）中细胞总数=： 325个细胞 × [2(稀释因子)/5个方格] × 10，000 细胞/ml = 130 ×104 细胞/ml 如果您想知道原先样本中有多少细胞，只需用总的样本量乘以细胞浓度即可。 例如，如果您原先的样本量是5ml，则您的样本中总计拥有=: 130 ×104细胞/ml × 5ml = 650×104个细胞