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实验十四 PCR实验 一．原理 用PCR扩增-637bpDNA 扩增产物用1．5％琼脂糖凝肚电泳鉴定 二．方法 （一）.PCR 1.取一0.2ml微离心管，依次加入： 反应物 加样顺序 加样体积 终浓度 灭菌重蒸水 1 33μl 10 x 反应缓冲液 2 10μl 1 x 缓冲液 4 xdNTP混合物 3 4μl 200μmol/L 引物1 4 1μl 10pmol 引物2 5 1μl 10pmol DNA模板 6 1μl 10ng Taq DNA聚合酶 7 1μl 2.12000r／min离心2S。 3.按下列步骤，在DNA扩增仪上进行35次循环。 (1)92.5℃ 45秒 (2)50℃ 45秒 (3)72.5℃ 90秒 1．置72℃ 5分钟 (二)PCR产物电泳分析 1．制备琼脂糖凝胶 称取琼脂糖0.225克，溶解在15ml电泳缓冲液中，置微波炉中至琼脂糖溶化均匀。 2．灌胶 将电泳槽两侧密封好，防止浇凝胶板时出现渗漏。然后在凝胶溶液中加EB3μl，摇匀，插好点样梳子，轻轻倒入电泳缓冲液。除去气泡。 (1)PCR产物：PCR产物(下层水相)15μl十3μl溴酚蓝指示剂混匀、点样 (2)分子量标准DNA：分子量标准DNA DL200点样5μl。 记录点样次序与点样量 5．电泳 接上电极线，点样槽侧接电泳仪负极，另一侧接电泳仪正极，50V电泳30至60分钟 6．观察结果 将电泳槽拿到暗室。在紫外检测仪上，紫外灯下直接观察结果， 三、试剂 1．TaqDNA聚合酶 2．10 X PCR缓冲液 500mmol／L DNA聚合酶 100mmol／L Tris—HCL pH9．O 15mmol／L MgCI2 0.1％明胶 l％Trilon X—100 3．4 x dNTP混合物 2．5mmol／L dATP 2．5mmol／L dGTP 2．5mmol／L dCTP 2．5mmol／L DTTP 4. 引物1(10pmol/μl) 引物2(10pmol/μl) 6.DNA模板 7．灭菌重蒸水 8．电泳缓冲液(见实验六) 9．溴酚蓝指示剂(见实验六 10．EB(见实验六) 11．琼脂糖 12．分子量标准DNA，DL2000，TaKaRa 分子量大小(bp)：2000、1000、750、250、100 四、仪器 1.PCR扩增仪：PE9600型PCR仪 2.微波炉 3.电泳仪 4.手提式紫外检测仪 5.微型台式离心机 五、说明 1．PCR产物克隆 在PCR进行之后，经常要对PCR产物进行克隆，即将PCR产物与载体（一般是质粒载体）连接，要使PCR产物与载体正确连接．可以在PCR引物中加人限制性酶切位点序列及适当的保护碱基，PCR之后，对PCR产物进行酶解，然后与用相同酶解的载体进行连接。由于采用TaqDNA聚合酶的PCR实验，其扩增产物3，—末端有一突出的核苷酸，且主要是腺嘌呤核苷酸(A)，因此不能简单地采用平齐末端连接法对PCR产物进行克隆。如果要用平齐末端连接法连接则应该用酶将PCR产物末端补平，然后进行连接。更常用的办法是用末端含T的载体进行克隆。此类载体有TaKaRa的Pmd18-T、Promega的pGEM—T Vector System、Invitro gen的Original TA Cloning KiT、Eukayrotic TA Cloning Kit—Unidirectional、Eukayrotic TA Cloning Kit –Bidirectional、Baculovirus TA Cloning Kit,RD Systems的LigATor Kit, Amershan的pMOSBLUE T-Vector Kit等。但使用T载体要注意某些DNA聚合酶如Pwo。不产生类似的末端。此外，引物5，—末端碱基不同，PCR产物的3，—末端也有差异，详见下表