离子交换树脂：.docVIP

離子交換樹脂： Fig.1 蛋白質表面的極性或非極性分佈 SOD: Superxoide dismutase；有些健康食品中的抗氧化劑常含有許多這種酵素，，將的H調到Counter ion被吸附到擔體上之後再想辦法溶離下來，一般來說都是用鹽梯度，陰離子和陽離子間以離子鍵結合，可以用NaCl來破壞這種吸引力，其中Na+會跟負電結合，Cl-則會跟正電結合。 假設現在要把帶兩個負電及帶一個負電的蛋白質從這個擔體溶離下來，漸漸提高鹽的濃度，則帶一個負電的會先被溶離下來，接著是帶兩個負電的蛋白質。要注意的是，有的蛋白質無法忍受太高濃度的鹽，可能會導致蛋白質變性，失去活性。 離子取代的順序叫pecking order， Fig.2 拉鹽梯度有兩種方式，連續梯度需用梯度製造器，階段梯度則每過一段時間換一種濃度。 在整個離子交換法中很重要的一點是，真正有分離作用的只有膠體的部分，在膠體上方的空間叫dead volume (無效空間)，在作離子交換法時，要盡量減少無效空間，因為無效空間會使得流進來的濃度梯度被破壞，失去梯度的連續性 Fig.3 圖中的A可視作抗體，B則是其抗原，X則為不要的雜質。在第一個圖中，B夾雜在樣品中；第二個圖中，B被A吸附住了，雜質則被沖洗出來；第三個圖中，B就被溶離純化出來了。 親和層析法的先決條件要找到有親和力配對的物質，並不是每個蛋白質都可以找到，但現在遺傳工程的技術可以在蛋白質序列的前面或後面加上一個tag，然後就會有一個相對的物質和此tag有親和力可以結合。 金屬螯和層析法 (metal chelate affinity chromatography)就是一種親和層析法，在其bead上會接有一些小基團，小基團上會帶有兩個COO－－有大有小 Fig.4 可利用物質的不同特性，將所要的物質分離出來。 細胞中蛋白質的純化與分離：（Fig.5） 要純化細胞中某一個酵素，第一件事要先把細胞作均質，把細胞打碎，打碎之後分成幾個部分，其中的細胞碎片是不要的部分，可溶的部分可分成小分子及巨分子，巨分子中有核酸、、 Fig.5 各種純化及分析蛋白質的方法 Ultrafiltration：超微過濾，利用一個帶有很多小洞的膜，其大小可辨別分子大小Chromatofocusing：現在較少用。 HIC：hydrophobic interaction chromatography，跟HPLC很像，但是是利用低壓。 Hydroxyapatite：一種陶土，可吸附蛋白質，吸附的原理尚不清楚，對不同的蛋白質有不同親和力。是一種很好用的純化方法。 各種純化方法的應用次序： Fig.6 各種蛋白質純化方法的應用次序統計 以應用次序的統計來說（Fig.6），第一步都是先用均質；沈澱法放在第二步使用的比較多；離子交換法則多用在第三步或第四步；親和層析法在各個步驟都有；而膠體過濾法多半放在比較後面的步驟，可能是利用在脫鹽，把小分子去掉。沈澱有時也會用在第一步，例如在做液體的樣本時，就不需要均質，可直接做沈澱。有時會同一個方法用兩次，但兩次方法的應用必須是不同目的；例如在做離子交換法時，第一次使用可以先把環境的pH值調到蛋白質的pI之上，用陰離子交換法，經過幾個步驟之後，再把pH值調到pI之下，用陽離子交換法。在實際應用上，這些純化方法都可以因目的不同作不同的組合應用。 現階段的酵素活性分析方法： 蛋白質定量－利用蛋白質的分子構造 酵素活性分析－利用有催化活性的巨分子 膠體電泳法－利用Native及SDS PAGE 免疫轉印法－利用抗體的專一性 Proteomics－利用解開的基因序列加上大量database 壹：蛋白質定量 一、各種蛋白質定量法：（Fig 7） 蛋白質的主要架構：蛋白質分為脊股和side chain兩部分，脊股是以NCCNCCNCC為主要的結構，在C和N之間為peptide bond，加上一些帶有極性或非極性的蛋白質side chain所組成。 Fig.7：蛋白質定量方法—1.Biuret Method；2.Lowry Method；3.UV Absorbance；4Comassie Blue G；5.Special Binding Groups（heme） Biuret Method： 利用蛋白質上的兩個carboxyl group 接上Cu2+離子，當蛋白質接上銅離子之後，會使得銅離子變色，呈現紅色，因此此種方法是利用蛋白質上的脊股來做定量，但是因為呈現的強度不強，所以有更多的定量發法出現，但是此種方法屬於很準確的方法，因為脊股上衣定有carboxyl group所以一定可以測出來只是非常不精確。 為何此種方法稱為Biuret Method？是因為銅離子接上的地方很像兩個urea（尿素）因此稱此種方法為Biuret Method。