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TGFβ3真核表达载体转染骨髓基质干细胞促进其向软骨分化的实验研究_计算机论文 TGF真核表达载体转染骨髓基质干细胞促进其向软骨分化的实验研究_计算机论文 作者：郑东，杨述华，袁晓梅，李进，冯勇，徐亮，梅荣成 【摘要】 目的］构建生长转化因子(TGF含绿色加强绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2，然后用该质粒转染骨髓基质干细胞(Marrow stromal cells,MSCs)并促进MSCs向软骨方向分化。［方法］用RT法从大鼠的胚胎组织中提取TGF的DNA全长，首先连接到pMDl8载体，扩增、纯化后经测序公司测序确定插入目的基因序列的正确性，然后再用带有EcoRI、PstI内切酶的引物，从pMD18将TGF的全长再次扩增出来，最后将带有酶切位点的TGF的全长插入到真核质粒pIRES2中，构建真核表达载体pIRES2。体外培养大鼠MSCs，应用阳性脂质体将pIRES2转染到MSCs中，24 h后在荧光显微镜下观察蛋白的表达，流式检测MSCs的转染效率；Westen Blot检测TGF蛋白的表达；之后进行MSCs细胞球团培养，分别于第7、14、21、28 d检测软骨基质胶原Ⅱ，胶原X和Aggrecan的表达，同时用甲苯胺蓝检测蛋白聚糖(proteoglycan)的表达。［结果］测序结果和酶切鉴定结果表明成功的构建了pIRES2质粒，转染MSCs之后，转染的效率达30％。Westen Blot结果表明TGF获得了成功的表达，在接下来的细胞球团培养过程中，转染后MSCs被成功诱导向软骨分化。 【关键词】 转化生长因子β3克隆 软骨分化 软骨组织工程 软骨修复 真核细胞 骨髓基质干细胞　　生长转化因子TGF(transforming growth factor)在软骨的发育和分化中具有重要的作用，在TGF家族中，TGF-β3在间充质细胞系(mesochymal cells MCs)中表达最为明显，并且在MCs的分化和发育过程中具有广泛的生物学效应，其中在促进骨髓基质干细胞(marrow stromal cells,MSCs),向软骨细胞分化的过程中的作用尤为明显［1］。研究表明，TGF在MSCs向软骨分化过程中细胞的聚集、增殖和分化的阶段都发挥了重要的调节作用，且通过体外培养的MSCs中加入TGF，已成功和高效的诱导了MSCs向软骨细胞分化［2］，因此学者们将TGF等生长因子的应用视为治疗关节损伤和修复软骨损伤的一个新的重要方向。但单纯加入外源性TGF很难研究TGF在体内诱导MSCs向软骨分化的过程，因而无法进行治疗性的研究。单纯在体内直接注射TGF促进MSCs向软骨分化和修复软骨的实验国外有人做过，但副作用大，疗效不能持久［3］。将TGF转染到MSCs，通过旁分泌和自分泌的方式起作用就能避免TGF的副作用持久发挥疗效。本实验在构建pIRES2真核表达载体的基础上，进行了体外转染和诱导MSCs向软骨细胞分化的实验研究，并为进一步的体内实验和构建用于基因治疗的载体如腺病毒载体等提供了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　质粒pIRES2，细菌DH5α(本实验室保存)；PCR Marker、限制性内切酶EcoRI、Pst I、pMD18、凝胶回收试剂盒购自TakaRa公司；T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶为MBI公司的产品；Trizol试剂盒、质脂体Lipofectamine TM2000转染试剂盒(Invetrogen公司)；小量质粒抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程公司)；DMEM、胎牛血清、胰酶、Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶为GBICO公司产品；其它试剂分别为国产和进口分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 扩增TGF基因全长 取1周龄SD大鼠(同济医学院动物房提供)胚胎的中胚层组织(胎鼠的胚芽组织)，匀浆后用Trizol试剂盒提取总RNA，提取2 μg的总RNA通过逆转录试剂盒转录成cDNA，行PCR扩增TGF的编码序列(全长)，上游引物：5’GCCACCATGAAGATGCACTTACAAAGG 3’下游引物5’GCCTCAGCTGCACTTACACGACTTC 3’，长度1242bp。反应条件：94℃变性3 min，然后94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 2 min循环30次，然后72℃延伸10 min，产物行琼脂糖(1％)凝胶电泳，切取大小约为1242bp的条带，用凝胶回收试剂盒回收并纯化。 　　1.2.2 T载体连接 按载体说明书给出的体系进行TGF扩增产物和pMDl8的连接。连接产物加入至100 μl的感受态细菌DH5α中，冰上放置30 min。42℃加热90 s后，冰上1 min。再加入890 μl SOC培养基，37℃振荡培养60 min，8 000 r/min离心5